微生物實驗室進化的研究進展

朱晁誼，朱牧孜，李 爽

(1.華南理工大學 生物科學與工程學院，廣東 廣州 510006；2.廣東省微生物研究所 省部共建華南應用微生物國家重點實驗室 廣東省菌種保藏與應用重點實驗室 廣東省微生物應用新技術公共實驗室，廣東 廣州 510070)

近年來，隨著合成生物學的快速發展，通過基因工程及代謝工程構建微生物細胞工廠生產高附加值化合物變得極具吸引力。盡管微生物細胞工廠在化工、食品、制藥、醫療和農業等領域已取得諸多成果，如已處于商業規模生產的1,4-丁二醇(1,4-butanediol)[1]和重要藥物前體青蒿酸(artemisinic acid)[2]，但獲得適用于工業化大規模生產的高產菌種仍是目前一大難題[3]。微生物細胞生長及生產往往涉及多種表型的協調優化，受多個基因及環境因素相互作用的影響，即使以基因背景充分解析的微生物為宿主，依然存在許多不可預測的因素，限制了人們對微生物工廠的合理設計。因為微生物普遍具備遺傳與變異的進化特性，所以讓微生物通過進化自主完成系統表型優化，實現目標化合物的高產，是21世紀由石油化工向生物化工轉型過程中科學研究的一大熱點。

1 微生物自適應實驗室進化

一般來說，微生物在適應環境過程中，菌體必然會發生變異，改變某些表型，這是進化的必然趨勢。在該理論的支持下，微生物自適應實驗室進化(adaptive laboratory evolution,ALE)應運而生。ALE是指通過施加人為干擾及控制微生物生長環境實現微生物進化。與代謝工程相比，ALE不需要考慮菌體錯綜復雜、相互交叉的代謝網絡，只需根據目標設計對應的干擾因素，具有微生物適用性廣泛及實用性強的優點，易于發現新機制、實現表型優化[4]。

自20世紀末開始，越來越多的學者使用ALE技術改造菌株以實現所需的功能。Caspetal等[5]通過對S.cerevisiaeCEN.PK113-7D實行ALE實驗以篩選耐熱性菌株，在39.5 ℃條件下連續傳代超過300代，最終突變株在40 ℃條件下的比生長速率提高了1.57倍，乙醇與甘油的產量分別提高了1.6和1.3倍。菌株全基因組測序及轉錄組測序分析表明，酵母耐熱性提高與固醇合成途徑某些基因的突變及表達增加有關。筆者所在的課題組的Zhu等[6]和Yang等[7]也曾利用ALE實驗對2株經代謝工程改造過的嗜熱厭氧桿菌T.aotearoenseSCUT27進行了高濃度底物耐受進化實驗，產乙醇突變株SCUT27/Δldh和產乳酸突變株LA1002分別在梯度增加碳源的培養基中經過58和40次傳代；在5 L發酵罐研究中，突變株SCUT27/Δldh-G58比出發菌株的遲滯期縮短75 h，乙醇產量提高了1.6倍；LA1002-G40在48 h內完全發酵含100 g/L糖的廚余水解液，乳酸產量和轉化率分別達68.03 g/L和0.79 g/g，而LA1002未見生長。最后，轉錄組數據和胞內溶質研究顯示，高滲透壓環境促使嗜熱厭氧桿菌調控自身UDP-glucose代謝、氨基酸代謝等多個通路，使可作為滲透壓保護劑的谷氨酸(Glu)和甘氨酸(Gly)等氨基酸胞內的含量增加了1.42～2.90倍，并上調了應對環境壓力的DNA修復相關基因的表達。這充分說明了ALE實驗在實現菌株定向進化方面的便捷性和有效性。

在具體實踐中，ALE實驗以特定的選擇壓力為基準篩選表型增強的突變體，多應用于提高工業菌種在不同生產條件下的穩定性及耐受性，如溫度耐受性[5]、離子液體耐受性[8]及有效利用次優碳源[9]等。然而，在獲得高產化合物的進化研究中，由于化合物的生產通常會加重細胞負擔或產生細胞毒性，這種傳統的ALE實驗方法往往出現相反的結果[10]。因此，在提高化合物產量的進化研究中，將目標化合物的生產與微生物生長耦聯起來，是目前應用ALE實驗的一種有效方法。Reyes等[11]利用類胡蘿卜素具有抗氧化的特性，刪除了酵母細胞體內正常清除活性氧(ROS)的途徑而使得類胡蘿卜素成為細胞抵御ROS的主要來源，通過周期性施加過氧化氫刺激的方法進行ALE實驗，最終類胡蘿卜素產量提高約3倍。

2 提高微生物實驗室進化速度的策略

ALE實驗可不需要預先產生目標基因的突變庫，通過施加環境壓力促進微生物進化，但微生物自發突變率很低，需要通過長期傳代培養以富集突變。因此，為提高微生物進化速度，通常需增加出發菌株的基因多樣性。

基因多樣性可以通過多種方法產生，從完全無靶向的全基因組誘變到針對特定基因的完全靶向方法，皆有文獻報道。早期研究中，常使用增變菌株為宿主(如E.coliXL1-Red，其全基因組突變率為野生型菌株的5 000倍)[12]，利用紫外誘變或化學誘變[13]構建突變庫等方法建立基因多樣性，但其不穩定性及無目的全靶向等弊端限制了其大范圍使用。

近年來，比起完全無靶向的全基因誘變或對目的基因深入了解的全靶向突變方法，連續定向進化方法更受廣大學者青睞，其最重要的一個特征是能以這一種不會擾亂宿主生長的方式調節目的基因進行進化[14]。以下介紹將突變局限于目標基因的定向進化方法(體外或體內構建突變體)，很大程度地避免宿主其他基因的突變。

2.1 體外構建突變庫

在體外采取隨機突變產生目的基因突變庫是一種較為有效的半靶向方法，如易錯傾向的PCR(error-prone PCR,epPCR)[15]。這種基于PCR的方法利用低保真DNA聚合酶可快速構建基因突變庫，經濟省時，但低保真DNA聚合酶傾向于產生特定類型的突變，導致epPCR突變庫產生某種偏向性，縮小了突變庫的有效規模。目前，可以通過改變PCR反應中dNTPs的比例或使用多種不同偏向的易錯DNA聚合酶來克服該缺點。此外，一些常規的體外構建突變庫的方案，如DNA shuffling等可以詳細參考相關綜述[16]。

近年來，體內位點特異性突變及自動化技術的進步為微生物持續定向進化提供了機遇[17-18]，在初步了解與表型相關基因組區域的情況下，這些方法可有效規避隨機突變的偏向性及不可控性等問題。

Wang等[19]成功開發出多重自動化基因工程技術(multiplexed automated genome engineering,MAGE)，如圖1(a)所示，通過單鏈DNA(single-stranded DNA,ssDNA)實現E.coli染色體上多位點的同時突變，實現基因組合多樣性。通過改造E.coli的限制修飾系統，引入噬菌體的λ-Red ssDNA結合蛋白β，大大提高ssDNA的整合效率，并通過自動化裝置實現快速連續定向進化。應用這套系統優化E.coliEcNR2的1-脫氧-d-木酮糖-5-磷酸鹽(DXP)合成途徑生產番茄紅素，針對DXP途徑中的24個基因，設計一系列特異性突變的ssDNA，利用MAGE技術連續隨機整合至宿主染色體，每天可創造超過43億個的突變體，并在3 d內使番茄紅素產量提高超過5倍。MAGE技術自首次實現多基因位點的快速突變以來，目前已多次成功用于大腸桿菌的代謝途徑優化[20-21]，并有學者將此方法用于釀酒酵母中，演化出酵母寡聚核苷酸介導的基因工程技術(yeast oligo-mediated genome engineering,YOGE)[22]。

CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic rep)系統的問世大大方便了生物基因組的靶向編輯，同時也被學者們研究發展應用于定向進化中。Ronda等[23]將CRISPR-Cas9與MAGE技術結合創造了CRMAGE技術，將重組效率由0.68%～5.4%提高至96.5%～99.7%，大大提高了進化效率。此外，Gill課題組的Garst等[24]開發了一套CRISPR激活的可追蹤基因工程技術(CRISPR-enabled trackable genome engineering,CREATE)，如圖1(b)所示，該系統關鍵在于構建包含gRNA與同源修復片段的CREATE表達盒，既完成位點突變，實現基因組的多樣性，也充當追蹤標記，篩選完成后快速發現基因型與表型間的聯系。此后，Gill課題組的Liang等[25]將此技術應用于提高E.coli異源生產異丙醇中，在常規實驗室條件下，不依賴全基因組測序，幾天內生成并鑒定了近千個單基因和多基因組合突變體，最終獲得異丙醇產率提高3倍的E.coli突變菌株。

2.2 體內構建突變庫

前述的方法均是在ALE實驗前獲得基因多樣性，如果能夠在ALE實驗過程中獲得基因多樣性而不影響宿主菌株的正常生長，可簡化操作、減少人為干擾，更有利于實現定向進化的連續性。

2011年，Esvelt等[26]開發的噬菌體輔助連續進化技術(phage-assisted continuous evolution,PACE)(圖2(a))，將目的蛋白活性與噬菌體的生命周期耦聯，在恒化連續裝置的輔助下，8 d內實現無人為干擾的目標蛋白質200代進化。整套系統利用噬菌體M13的增殖依賴于pIII蛋白這一特性，將需進化的目的基因替換原來的pIII蛋白基因，構建1個含目的基因的pIII蛋白缺陷型的選擇噬菌體(selection phage,SP)，而宿主E.coli則包含2個主要質粒：輔助質粒(accessory plasmid,AP)和致突變質粒(mutagenesis plasmid,MP)。AP主要包含與目的基因活性相耦聯的pIII蛋白基因，SP必須進化出有活性的突變，才可啟動AP上pIII蛋白表達，噬菌體才可獲得增殖能力并持續侵染其他宿主，實現連續進化。而MP則含有4個dnaQ926、umuC、umuD′和recA730受阿拉伯糖調控的基因，經誘導可產生隨機突變，提高整個系統的突變率。此外，為了將作用于所有基因的隨機突變限制于噬菌體的目的基因處，他們引入恒化器裝置，流入新鮮的宿主細胞，并設置流出速度稍快于宿主的復制速度，故只有獲得有益突變從而完成增殖的噬菌體可以持續侵染新宿主，在恒化器中富集，而無法實現突變完成增殖的噬菌體則最終會流失。利用這套系統可進化任何與pIII蛋白表達耦聯的蛋白，而目前將酶的多種功能與報告蛋白的表達相耦聯的研究進展為PACE技術應用于多種蛋白或酶的改造提供了可能。目前該技術已應用于RNA聚合酶[27]、aminoacyl-tRNA合成酶[28]或毒素[29]等蛋白的進化研究中。

盡管PACE在連續定向進化蛋白質方面有突出的貢獻，但目前它的宿主只限于大腸桿菌，無法用于酵母等真核生物。2016年，Crook等[30]建立了一套以轉座子為基礎的酵母體內定向進化方法(invivocontinuous evolution,ICE)(圖2(b))。ICE系統的關鍵在于易錯傾向的Ty1逆轉錄酶。具體來說，整合至Ty1逆轉錄識別區域的目的基因首先被轉錄，接著易錯傾向的Ty1逆轉錄酶表達并逆轉錄目的基因形成cDNA，產生基因多樣性之后，Ty1整合酶再將其重新整合至基因組上，完成一輪突變。這套利用逆轉錄轉座子進行體內誘變的系統可以擴展到任何支持LTR逆轉錄轉座子活性的真核生物內，宿主應用范圍廣泛，他們應用這套系統增強轉錄因子SPT15對1-丁醇的耐受性，改變脫羧酶的底物特異性，提高木糖分解途徑通量，展示出ICE系統對轉錄因子、單酶甚至多酶途徑進化的高效可行性。

利用正交復制的突變質粒來實現靶基因突變也是目前較受歡迎的一種方法，這種方法最大的特點就是幾乎不改變宿主基因組，不影響宿主的正常生長，適合于酶的進化。這一策略最早期是由Fabret 等[31]在大腸桿菌中實現，他們利用DNA聚合酶Ⅰ(DNA PolⅠ)在細胞內優先復制質粒上的基因且只復制染色體一小部分的特點，構建低保真度的DNA PolⅠ突變體，完成質粒基因的突變而不影響宿主基因。后來，Camp等[32]進一步增強了DNA PolⅠ的錯配率，實現TEMβ-內酰胺酶的連續進化。除了在大腸桿菌中應用，這種策略后來還被Liu Chang課題組的Ravikumar等[33-34]推廣至釀酒酵母的靶向突變中，他們在釀酒酵母中建立1個由正交DNA質粒-DNA聚合酶對組成的細胞核外復制機制，并通過構建易錯傾向的DNA聚合酶建立一套獨立于宿主的體內連續進化系統(OrthoRep)，其體內質粒突變率是宿主基因組的10萬倍(圖2(c))。此后，Ravikumar等[34]借助此系統，在釀酒酵母中對惡性瘧原蟲來源的二氫葉酸還原酶(PfDHFR)進行連續進化，最終獲得對乙胺嘧啶耐受性提高4萬倍的突變體。最近，Liu Chang課題組的Arzumanyan等[35]對此系統進一步發展，在1個細胞中構建了pGKL1質粒/TP-DNAP1聚合酶對與pGKL2質粒/TP-DNAP2聚合酶對2個彼此正交的DNA復制系統，這樣一對正交復制系統通過調節2個聚合酶的錯配率，實現體內多基因的不同速率的進化。

除了用于正交質粒上的靶基因的連續進化，將易錯傾向的DNA聚合酶用于基因組上任意靶基因的突變將更具應用價值。最近，美國加州大學的Halperin等[36]將易錯DNA聚合酶與CRISPR技術相結合，構建了一種名為“EvolvR”的體內進化系統(圖2(d))。該系統將只產生單鏈斷裂的nCas9蛋白突變體與易錯傾向的缺口DNA聚合酶突變體融合，由gRNA引導至特定靶序列，隨后nCas9蛋白切割產生單鏈缺口，易錯的DNA聚合酶從缺口處開始補上新的核苷酸，替換下游的核苷酸，對靶基因生成一系列突變體，在1 d內完成整個進化過程。一方面通過CRISPR系統規定了靶基因突變的起始位點，并以多組gRNA的共表達實現對基因組上多個靶位點的同時進化；另一方面通過調節DNA聚合酶突變體的持續合成能力、保真度及錯誤插入偏好性，從而相應地控制靶基因的突變序列長度、突變率及核苷酸替代偏好，由此，理論上可實現所有物種的任意多個靶基因的體內持續進化。

圖2 體內構建突變庫示意圖Fig.2 Schematic diagram of in vivo targeted mutagenesis

將現有的微生物實驗進化策略的詳細內容進行總結，見表1。

3 連續自動化培養技術的發展

事實上，不管是近年來發展迅猛的連續定向進化策略還是早期依賴環境選擇壓力的適應性進化方法，皆是基于微生物連續繁殖、富集突變而獲得特定表型的進化過程。微生物的連續培養繁殖主要是通過手動連續稀釋或自動化培養裝置實現的，前者容易出現種群瓶頸、培養密度波動及選擇壓力不均勻等問題；而后者的應用卻常遇到生物膜積累、培養環境受限及高成本等阻礙，因此在推動微生物實驗室進化的進程中，連續自動化技術的發展尤為重要。

為解決生物膜積累的問題，de Crecy等[37]開發了一種叫“Evolugator”的連續進化裝置，在生物反應器中設置不同隔離分區，以與動態控制器相連的濁度計的測量值來調節培養物的循環，達到減少生物膜形成和抑制貼壁生長的目的。利用這個平臺，研究人員在4個月內成功進化出2株耐高溫的昆蟲病原真菌突變株，廣泛應用于害蟲防治[38]。

隨著低成本及人性化的培養設備的研發，一些適用于小實驗室的連續自動化裝置漸漸發展起來，如Matteau等[39]設計的多功能連續培養裝置(versatile continuous culture device,VCCD)、Takahashi等[40]設計的具有開發資源的多路復用恒濁器(Flexostat)及Hoffmann等[41]設計的基于擴展卡爾曼濾波器原理估計細胞增長率的低成本恒濁器等，這些裝置皆具有由3D打印或易于操作的部件制成、受開放資源的軟件控制的特點。

此外，近幾年液體處理機器人[42]、微型恒化器陣列[43]及微液滴恒化器[44]等的出現，推動了連續自動化裝置與高通量平行化培養篩選策略的結合，在微生物實驗室進化過程中對選擇參數、突變率及突變范圍實現更高程度的控制，并一定程度上限制了人為干預。最近，Wong等[45]開發了一種名為“eVOLVER”的可任意縮放及實現用戶自定義的裝置，其開源的濕件、軟件及硬件等高度模塊化，可實現快速重新配置以適應幾乎所有的自動化連續培養實驗，實現實驗室進化過程中自動化培養過程的高度可控性及高通量性的平衡。

表1 微生物實驗室進化策略的對比

4 總結

實驗室定向進化大大加速了人類改造蛋白質、代謝途徑甚至細胞的步伐，在發現蛋白質新功能、提高酶活性及提升微生物細胞工廠產能等研究中具有應用潛力。連續進化方法，可有效打破基因突變范圍、篩選能力及突變率等傳統進化方法的遺傳瓶頸，大幅度減少人為操作，為同時進行多個平行進化實驗提高可行性，也減少人為因素帶來的實驗誤差，大大推動了微生物實驗室進化的發展。

體內連續進化方法也有其自身的缺陷，如連續培養過程中逃逸篩選的無效突變菌株的擴增、對自動化設備的高度依賴等，故體內連續進化應與其他實驗室進化方法相互補充，而非簡單替代。目前計算機輔助的體外進化設計技術的普及[46-48]、生物分子功能與報告分子或細胞生長耦聯技術的廣泛研究[49-50]及連續自動化技術的進步等，將為充分實現微生物實驗室進化的潛力發揮出關鍵作用。