miRNA調控昆蟲與病毒互作的研究進展

魯 莎， 郭建洋， 席 羽， 萬方浩,,*

1青島農業大學植物醫學學院，山東 青島 266109； 2中國農業科學院植物保護研究所植物病蟲害生物學國家重點實驗室，北京 100193； 3中國農業科學院深圳農業基因組研究所，廣東 深圳 518120

作為非編碼RNA家族重要成員之一的miRNA是一類長度為18～25個堿基的小RNA分子，在基因的轉錄后調控中發揮重要作用，可以通過mRNA剪切或者抑制蛋白質翻譯的方式負調控靶標基因(Florisetal.,2016; Kraussetal.,2018)。Leeetal. (1993)在秀麗隱桿線蟲Caenorhabditiselegans中發現了第一個miRNA：lin-4，負調控lin-14基因表達，使其在翻譯水平上受到抑制。隨后第二個miRNA分子let-7也在線蟲中被成功鑒定，與lin-4調控機制相似(Reinhartetal.,2000)。此后被鑒定的miRNA的數量快速增長，截至2018年3月，在miRNA序列數據庫miRBase (http:∥www.mirbase.org/)第22版中收錄miRNA前體38589個，共計產生48885個成熟miRNA，涵蓋了271個物種，其中包括33種昆蟲、35種病毒；另有一專門針對病毒miRNA的數據庫Vir-Mir (http:∥alk.ibms.sinica.edu.tw/cgi-bin/miRNA/miRNA.cgi)統計獲得病毒miRNA前體30439個，其中雙鏈DNA病毒(dsDNA)26339個，昆蟲中主要存在的桿狀病毒miRNA前體1683個。研究表明，miRNA可以調節大約50%的蛋白編碼基因，參與包括生長發育、細胞分化、細胞凋亡、激素分泌等多種生理過程(Taftetal.,2010)，以及包括肺癌、結腸癌、病毒感染等多種病理過程(Gangaraju & Lin,2009; Katsushima & Kondo,2014)。

病毒是害蟲生物防治中的一種主要防治措施，然而，隨著病毒制劑的不斷應用，昆蟲與病毒之間相互作用、協同進化，昆蟲發展出對病毒的抗性，而病毒也相應發展出應對這種抗性的對策。近年來，隨著miRNA不斷被發現，昆蟲與病毒中產生的miRNA研究熱度增大，其在兩者互作中的調控作用也成為關注熱點。宿主昆蟲與病毒的基因組都能編碼miRNA，這些miRNA能調控大量基因的表達。研究表明，病毒侵染后的昆蟲，其體內的miRNA表達水平發生顯著變化(Wuetal.,2013)，引起差異表達的原因可能是宿主自身產生的免疫應答反應，也可能是病毒感染所誘導的調控因子導致；另一方面，病毒編碼的miRNA也可調控自身復制相關基因或直接作用于宿主免疫相關基因。本文從miRNA的生成、調控機制及其功能等方面綜述miRNA的生物學特性，重點闡述其在昆蟲和病毒互作中的調控作用，為害蟲生物防治提供新的思路。

1 miRNA的生成機制

成熟miRNA的形成過程包括若干步驟：首先，編碼miRNA的基因在RNA聚合酶Ⅱ啟動子的指導下被轉錄成初始miRNA(primitive miRNA, pri-miRNA)(Leeetal.,2004)。在細胞核內，pri-miRNA經RNaseⅢ家族的Drosha內切酶剪切后，形成帶有莖環結構的長70～100 nt的前體miRNA(precursor miRNA, pre-miRNA)(Leeetal.,2003)，這一過程中Pasha蛋白作為輔助蛋白與Drosha形成復合體(Yeometal.,2006)。加工好的pre-miRNA再由轉運蛋白Exportin-5從細胞核主動運輸到細胞質中。Exportin-5可特異性識別經RNaseⅢ(Drosha)剪切后在3′末端有2個未配對核苷酸的pre-miRNA，并保護pre-miRNA從核內到胞質的完整性(Zeng & Cullen, 2004)。轉運到細胞質中的pre-miRNA再進一步被Dicer(RNaseⅢ家族中專門消化雙鏈RNA的酶分為dicer 1和dicer 2，將長鏈dsRNA剪切成約21 nt的短鏈dsRNA)及其輔助因子TRBP切割成18～25個核苷酸長度的雙鏈miRNA:miRNA*分子。miRNA*雙體中成熟miRNA鏈會選擇性地整合到RISC(RNA induced silencing complex)中識別靶基因，通過與靶標mRNA的特定序列互補或不完全互補結合(Trujillordetal.,2010)，誘導靶標mRNA剪切或阻止其翻譯，從而調控靶基因表達；另一條鏈miRNA*或許會快速降解(Leeetal.,2003)。還有一些來源和上述過程不同的miRNA，稱為mirtron (Du & Zamore,2005; Ghildiyaletal.,2010)。mirtron由一些小的內含子經過剪接和去分支后，可不經過Drosha酶切而直接形成pre-miRNA，再進一步加工為成熟的miRNA (Yangetal.,2014)。

2 miRNA的調控機制

miRNA與RISC結合形成miRISC效應復合物后才能夠調控靶標基因的表達。通常由miRNA的種子序列(5′第2～8位核苷酸)來識別靶基因，有2種機制來調控靶基因的表達：mRNA剪切和翻譯抑制。miRNA與其靶基因的互補程度決定了它以何種機制沉默靶基因，當其與靶基因幾乎完全互補時就會使mRNA降解；當其與靶基因不完全互補時則會引起mRNA的翻譯抑制。盡管這個模型已被許多實驗證實，但在后續的研究中發現了例外，擬南芥Arabidopsisthaliana(L.)中miRNA-172盡管與靶標基因APETALA2有近乎完全的堿基配對，卻通過抑制靶標基因的翻譯而行使功能(Chen,2004)；哺乳動物的miRNA-196與靶標基因HOXB8的3′端非翻譯區(3′-UTR)幾乎完全互補，卻導致靶基因的降解(Kawasaki & Taira,2004)。而miRNA與靶標基因結合的位點也存在多種結合方式：早些時候認為miRNA的靶標位點位于靶基因的3′-UTR區，但Schnall-Levinetal. (2010)利用軟件MinoTar (http:∥www.minotar.csail.mit.edu)預測并通過實驗證實，在mRNA的編碼區和5′-UTR區也有很多miRNA的結合位點。Lytleetal. (2007)研究發現，let-7不僅靶向3′-UTR，同時靶向5′-UTR。 miRNA對基因的表達調控是一個十分復雜的機制，往往不是一對一的對應關系，有可能一個靶基因由多個miRNA共同調控，也有可能一個miRNA調控多個靶基因表達(Legeaietal. 2010; Yuetal.,2007)。

3 miRNA的功能研究

從第一個miRNA發現至今，已經有數以萬計的miRNA在不同的生物中被發現，miRNA在生物體中發揮的功能越來越引起人們的重視。目前對于其功能的研究主要還是通過基因突變或在miRNA的靶位點上引入突變來抑制miRNA的作用，通過觀察生物體的表型變化來推測miRNA的功能，這是一種反向遺傳學的研究方法(Jackson & Standart,2007)。另外一種推測miRNA功能的方法是對相應的miRNA進行過量表達。但是很多生物體的表型變化特征不明顯，因而人們開始利用表達譜分析和生物信息學方法預測靶基因來研究其相對應的miRNA功能。

對已發現的一些miRNA的功能研究表明，miRNA幾乎參與了生物體的整個生命過程，主要調控生理和病理2個方面。生理方面如細胞生長發育、組織分化、胚胎發育、細胞增殖、細胞凋亡及形態發生等。病理方面包括miRNA的異常表達會引起人類的各種疾病發生，如癌癥、心血管紊亂、艾滋病、白血病、糖尿病等(Kloosterman & Plasterk,2006)。實驗表明，miRNA在生物抵抗外界不良環境中起著十分重要的作用，miRNA的異常表達受環境壓力的影響，當miRNA表達量變化時可以影響相應的靶基因表達，從而使生物體更好地適應環境改變(Lema & Cunningham,2010)。例如，當寄生蜂Glyptapantelesflavicoxis(Marsh)寄生舞毒蛾LymantriadisparL.后，舞毒蛾體內相關miRNA發生顯著變化，從中發現miRNA對昆蟲適應環境變化起到了積極的促進作用(Gundersen-Rindal & Pedroni,2010)。

4 miRNA在昆蟲與病毒互作中的作用

4.1 病毒編碼的miRNA在宿主—病毒互作中的作用

目前，已確定300種能編碼miRNA的病毒,這些病毒包括皰疹病毒、桿狀病毒、腺病毒、多瘤病毒、囊泡病毒和主要侵染鱗翅目昆蟲的Nudivirus(Belluttietal.,2015; Kozomara & Griffiths-Jones,2014； Liuetal.,2017; Singhetal.,2014)。miRNA已經在不同的桿狀病毒如斜紋夜蛾核型多角體病毒(SpltNPV)、苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(AcMNPV)和家蠶核型多角體病毒(BmNPV)中被預測，其中一些已在實驗中證實:Kharbandaetal. (2015)預測了48個新的SpltNPV編碼的miRNA，其中10個在Sf21細胞中進行了驗證;AcMNPV-miR-1被證實在AcMNPV感染的細胞中表達，調節靶標基因的表達以達到促進病毒自身感染的目的(Zhuetal.,2013,2016)。為了揭示由BmNPV編碼的miRNA并闡明它們在BmNPV和宿主互作中產生的作用，Singhetal. (2010)通過檢測中腸和脂肪體組織中病毒miRNA的表達譜報道了4種BmNPV編碼的miRNA。其中一種miRNA：BmNPV-miR-3，可調節DNA結合蛋白的表達，在病毒侵染階段發揮重要作用。BmNPV-miR-3在BmNPV侵染早期階段表達，并對DNA結合蛋白進行負調控，使用鎖核酸技術(locked nucleic acid,LNA)抑制BmNPV-miR-3的表達后，DNA結合蛋白的表達量增加，同時病毒量增加，而過表達BmNPV-miR-3則導致其表達量減少，病毒量也相應減少。

隨著對miRNA的深入研究，病毒來源的miRNA在調節病毒—宿主互作中發揮的重要作用被更多發現。病毒miRNA可直接改變宿主生理機制，干擾宿主與病毒互作中的宿主防御機制。一些病毒miRNA，如KUN-miR-1和OvHV-2-miR-5直接與昆蟲宿主靶標基因相互作用，直接調控病毒感染和病毒復制(Hussainetal.,2012; Riazetal.,2014; Wuetal.,2016)。BmNPV-miR-1通過調節輸出蛋白-5輔因子Ran來抑制其宿主miRNA的表達，從而導致病毒增殖增強(Singhetal.,2012)。AcMNPV-miR-1是一種由AcMNPV編碼的miRNA，其堿基序列與病毒基因ODV-E25的編碼區完全匹配，通過下調ODV-E25 mRNA的表達削弱病毒的產生(Zhuetal.,2013)。Zhuetal. (2016)將Ac18和Ac95鑒定為AcMNPVmiR-1的2個新靶點，盡管AcMNPV-miR-1與ac18和ac95顯示不完全匹配，但它可同時調節它們的表達，總之，ac18的輕度表達和ac95的下調表達意味著AcMNPV-miR-1通過上調Ac18同時下調Ac95來抑制細胞感染和病毒復制。基于上述報道，可以認為病毒miRNA可能靶向大量細胞轉錄物和病毒，利用miRNA作為調節細胞環境的有效手段，構建病毒適宜生長的內部環境。

4.2 昆蟲編碼的miRNA在宿主—病毒互作中的作用

研究表明，病毒感染可誘導宿主miRNA表達譜的變化。miRNA微芯片測序結果表明，棉鈴蟲Helicoverpaarmigera(Hübner)感染棉鈴蟲核型多角體病毒(HaSNPV)后脂肪體內有127個差異表達的宿主miRNA(張松斗,2017)。埃及伊蚊Aedesaegypti(L.)感染登革熱病毒(DENV)會改變miRNA表達譜，在感染后第9天，23種miRNA表達量發生變化(Campbelletal.,2014)。白紋伊蚊AedesalbopictusSkuse感染DENV病毒后，miR-252在血淋巴中表達增加，并且抑制此miRNA導致病毒拷貝增加，而miRNA的過表達則抑制病毒繁殖(Yanetal.,2014)。埃及伊蚊感染ZIKV(一種主要由埃及伊蚊傳播的黃病毒)時，感染組織與未感染組織相比較，其17種miRNA表達量發生變化，其中aae-miR-2940-3p和aae-miR-1-5p明顯上調表達(Saldaaetal.,2017)。感染BmCPV的家蠶BombyxmoriL.和正常家蠶比較，有58個miRNA表達差異顯著，10個差異表達的miRNA通過qRT-PCR方法進一步被證實(施莉莉,2016)，它們在病毒感染后表達水平的改變意味著可能在病毒—宿主互作中起作用。而桿狀病毒感染時sfrmiR-184下調4種不同基因的表達(Mehrabadietal.，2013)。斜紋夜蛾Prodenialitura(Fabricius)幼蟲受到桿狀病毒感染后，大多數宿主miRNA表達水平下降，但在Sf9細胞中的miRNA、Bantam增加(Shietal.,2016)。

有些種類的病毒能夠利用宿主細胞的miRNA促進自身復制(Joplingetal.,2005)，而其他的一些宿主miRNA卻能阻止病毒增殖(Sanghvi & Steel,2012)。Wolbachia能夠利用埃及伊蚊miRNA調控宿主的基因(如metalloprotease、MCTl、MCM6和methyltransferase)表達來抑制登革熱病毒的復制或促進自身增殖(Osei-Amoetal.,2012)。當白紋伊蚊感染登DENV后，miR-252表達增加，并且當加入此miRNA抑制劑時導致病毒復制，而加入類似物時抑制病毒復制，推斷miR-252對DENV的復制侵染具有抑制作用(Yanetal.,2014)。HaSNPV能夠操縱棉鈴蟲miR-14下調Ha-ECR基因的表達，從而調節宿主幼蟲的生長發育以促進自身的復制(Jayachandranetal.,2013)。谷實夜蛾Helicoverpazea(Boddie)中的Hz-miR-24負調控編碼DNA依賴性RNA聚合酶家族的HvAV-3e的轉錄物DdRP和DdRPβ，從而對病毒復制起到調控作用(Hussain & Asgari，2010)。

5 總結與展望

miRNA的發現讓研究者對基因轉錄后調控機制的理解又進了一層。有關在昆蟲免疫方面起作用的miRNA報道極少，Kayvanetal. (2013)證實小菜蛾PlutellaxylostellaL. miR-8正向調節絲氨酸蛋白酶抑制劑serpin27的轉錄水平，serpin27調節Toll途徑的激活和參與昆蟲黑化反應的酚氧化酶，在被半閉彎尾姬蜂DiadegmasemiclausumHellen寄生后，miR-8表達水平降低，導致serpin27轉錄水平顯著下降，作為宿主免疫應答的一部分，miR-8及其靶標基因serpin27在寄生后下調表達來激活宿主免疫系統。Yuanetal. (2017)報道了serpin-5和serpin-9在棉鈴蟲感染桿狀病毒后上調表達，抑制黑化反應，降低棉鈴蟲的存活率。棉鈴蟲核型多角體病毒(HearNPV)是近幾十年來越來越多地被用作害蟲防治的生物殺蟲劑，在桿狀病毒殺死害蟲之前，它必須侵入并躲避宿主的免疫反應。

越來越多的昆蟲或病毒的miRNA被發現和鑒定出來，miRNA在昆蟲宿主與病毒互作中調控作用的研究也成為熱點。昆蟲miRNA能夠調控靶標基因抑制病毒在其體內的大量復制增殖，而病毒miRNA則利用宿主miRNA或自身產生的miRNA提高自身的增殖能力，從miRNA的角度揭示了昆蟲與病毒之間的相互作用影響與協同進化關系。進一步探索miRNA在昆蟲與病毒互作中的調控作用，可以為害蟲生物防治提供新思路與新方法；研究miRNA在昆蟲—病毒中的作用機制，可以為病毒制劑的研發提供理論基礎。