片仔癀對局灶性腦缺血/再灌注大鼠皮質中NMDAR1和GluR2表達的影響

張小琴，侯麗穎，強國芳，顧嘉琪，盧雙紅，許 文，黃鳴清

(福建中醫藥大學藥學院，福建 福州 350122)

腦血管疾病是目前致使人類死亡的三大疾病之一，是我國甚至世界醫療機構和衛生系統單位所面臨的需要攻克的難題。其中缺血性腦卒中在腦血管疾病中發病率最高，約占80%，是目前嚴重危害人類健康的疾病之一[1-2]。片仔癀(Pien-Tze-Huang，PZH)是由牛黃、蛇膽、麝香、三七等中藥經發酵制成的中成藥，是國家一級中藥保護品種，常用于熱毒血瘀所致急慢性病毒性肝炎、癰疽疔瘡、無名腫毒及各種炎癥，具有清熱解毒、涼血化瘀、消腫止痛的功效[3]。已有文獻報道[4-5]以及我們研究[6]證實，片仔癀能明顯改善大腦中動脈閉塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)所致局灶性腦缺血/再灌注大鼠的神經功能缺損，降低腦梗死體積，具有腦保護作用。但片仔癀對N-甲基-D-天冬氨酸受體1(N-methyl-D-aspartic acid receptor 1，NMDAR1)和谷氨酸受體2(glutamate receptor 2，GluR2)的mRNA及蛋白表達的影響尚未見報道，因此，本研究為了進一步探索片仔癀對MCAO大鼠神經保護的可能機制，擬對此進行研究，從而為片仔癀開發治療缺血性腦卒中提供實驗依據，擴大其臨床應用范圍。

1 材料

1.1實驗動物健康SD大鼠，♂，SPF級，體質量(300±10)g，由福建中醫藥大學實驗動物中心提供并飼養，許可證號：SYXK(閩)2014-0005。

1.2藥物與試劑片仔癀(漳州片仔癀藥業股份有限公司，批號1601003)；線栓(廣州佳靈生物技術有限公司，貨號L3800)；異氟烷(深圳市瑞沃德生命科技有限公司，貨號R510-22)；2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)(美國Sigma公司，貨號T8877)；RNA isolater(南京諾唯贊生物科技有限公司，貨號R401-01)；Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit(美國Thermo公司，貨號K1622)；SYBR Master Mix(美國ABI公司，貨號R11022)；RIPA裂解液、BCA蛋白定量檢測試劑盒(碧云天生物技術有限公司)；羊抗NMDAR1(美國Santa Cruz公司，貨號sc-1468)；兔抗GluR2(英國Abcam公司，貨號ab206293)；兔抗GAPDH(美國CST公司，貨號2118)；PCR引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1.3儀器R540小動物麻醉機(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)；ND2000C紫外可見分光光度計(美國Thermo公司)；Infinite M200 Pro 多功能酶標儀(瑞士TECAN公司)；C1000普通PCR儀(美國Bio-Rad公司)；7900HT實時熒光定量PCR儀(美國ABI公司)；ChemiDoc XRS+凝膠成像分析系統、Mini PROTEAN Tetra小型垂直電泳槽、轉印槽(美國Bio-Rad公司)。

2 方法

2.1實驗動物分組與給藥用銼刀將片仔癀錠劑制備成細粉，用雙蒸水制成36 g·L-1的混懸液。藥物配制后，于4 ℃冰箱保存備用，用前搖勻。將適應性喂養后符合體質量要求的大鼠隨機分為假手術組(Sham)、模型對照組(MCAO)和片仔癀預給藥組(MCAO+PZH)，每組12只。于造模前4 d開始灌胃給藥：MCAO+PZH組灌胃片仔癀藥液(180 mg·kg-1)，每天早晚各1次，末次給藥為造模前30 min。Sham組及MCAO組同法給予等量雙蒸水。

2.2模型的制備5%異氟烷深度麻醉大鼠后，用2%異氟烷維持大鼠麻醉狀態，參照課題組的造模方法[6-8]，固定大鼠仰臥位，剪開頸部正中皮膚，鈍性分離皮下組織，將右側頸總、頸外、頸內3條動脈分離出來，用縫合線結扎頸總、頸外動脈。動脈夾暫時夾閉頸內動脈遠心端，應用眼科剪45°在頸總動脈近心端剪一小口，插入合適規格的線栓，使其進入頸內動脈約18～20 mm，遇到阻力即停止，將線栓和頸內動脈一起結扎，消毒縫合皮膚。1.5 h后將大鼠再次麻醉，拆開縫合處，將線栓拔出，實現再灌注。Sham組僅分離頸總、頸外、頸內動脈，不進行結扎、栓塞。

2.3神經功能評分參照Zea-Longa 5分制[9]對大鼠進行神經功能缺損評價。0分：無神經缺損體征；1分：提尾時病灶對側前肢屈曲內收，不能完全伸展；2分：自由活動時向病灶對側轉圈；3分：行走時身體向病灶對側傾倒；4分：意識喪失，不能自發行走。評分過程由2人共同完成。剔除造模過程中死亡大鼠，以及取材時發現蛛網膜下腔出血的大鼠。

2.4TTC染色法測量大鼠腦梗死體積再灌注24 h時，10%水合氯醛過量深度麻醉處死大鼠，斷頭取腦，即刻放入鼠腦專用切片模具中，按2 mm的規格沿冠狀位將大腦切成7片，將切片置于2% TTC中浸泡10 min，翻一面繼續浸泡10 min，根據切片顏色結束染色過程，正常組織染成玫瑰紅色，梗死組織則呈現蒼白色。將切片按層面順序排列整齊并進行拍照，使用ImageJ軟件測定大腦健側半腦面積及梗死側正常組織面積，梗死面積由健側半腦面積減去梗死側正常組織面積，再乘以切片厚度(2 mm)即為梗死體積[10]。此計算方法可消除腦水腫的影響。

2.5qPCR法檢測大鼠缺血側腦組織皮質NMDAR1、GluR2mRNA表達于MCAO大鼠再灌注24 h時，取下各組大鼠缺血側腦組織皮質部分，迅速投入液氮中，-80 ℃保存。采用TRIzol法提取總RNA，RNA定量后再逆轉錄成cDNA，以cDNA為模板，應用SYBR Green熒光染料進行實時熒光定量PCR反應，檢測NMDAR1、GluR2基因的表達。NMDAR1引物上游序列為5′-TACAAGCGACACAAGGATGC-3′，下游序列為5′-GGGCTCTGCTCTACCACTCTT-3′，PCR擴增片段長度為108 bp；GluR2引物上游序列為5′-GCTGGTGGCTTTGATTGAGT-3′，下游序列為5′-TCTGCGAGGAAGATGGGTTA-3′，PCR擴增片段長度為101 bp；GAPDH引物上游序列為5′-CAACGGGAAACCCATCACCA-3′，下游序列為5′-ACGCCAGTAGACTCCACGACAT-3′，PCR擴增片段長度為96 bp。PCR擴增反應條件為50 ℃預熱2 min，95 ℃預變性10 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火/延伸60 s，其中變性、退火和延伸程序往復運行40個循環。以GAPDH為內參，計算各組Ct值同相對應內參之間的差值，最終得到2-ΔΔCt值，即實驗組與對照組之間mRNA的表達量相對差異值。

2.6Westernblot法檢測大鼠缺血側腦組織皮質NMDAR1、GluR2的蛋白表達取-80 ℃保存的大鼠缺血側腦組織皮質部分，進行總蛋白的提取，BCA法測定蛋白濃度，加入適當量的蛋白上樣緩沖液混勻、離心、變性、上樣。每孔加入30 μg上樣蛋白，SDS-PAGE凝膠電泳分離后，通過轉膜儀將蛋白轉移至PVDF膜，脫脂奶粉封閉2 h，NMDAR1(1 ∶500)、GluR2(1 ∶2 000)一抗4 ℃過夜，二抗室溫孵育1.5 h，采用ECL發光試劑顯色，并經ImageJ凝膠成像系統進行顯影檢測，分析目標條帶NMDAR1、GluR2及內參GAPDH的灰度值，計算出目標蛋白與內參的比值，對組間差異進行統計學分析。

3 結果

3.1片仔癀對MCAO大鼠神經功能評分的影響神經功能缺損評分顯示(Fig 1)，與Sham組相比，MCAO組大鼠神經功能缺損評分明顯升高(P<0.01)，表明MCAO大鼠造模成功；與MCAO組相比，片仔癀預給藥4 d，神經功能缺損評分明顯降低(P<0.05)。

Fig 1 Effects of PZH treatment on neurological score in MCAO n=12)

##P<0.01vssham;*P<0.05vsMCAO

3.2片仔癀對MCAO大鼠腦梗死體積的影響Fig 2的TTC染色結果顯示，正常腦組織因含有脫氫酶而被染成紅色，梗死腦組織因細胞膜損傷，導致脫氫酶被完全釋放丟失而不被染色。Sham組大鼠的腦組織均呈紅色，無梗死灶出現；MCAO組和片仔癀預給藥組均出現了不同程度的腦組織梗死。與Sham組相比，MCAO組大鼠腦梗死體積明顯增加(P<0.01)；與MCAO組相比，片仔癀預給藥4 d，腦梗死體積明顯降低(P<0.01)。

Fig 2 Effects of PZH treatment on infarct size in MCAO

##P<0.01vssham;**P<0.01vsMCAO

3.3片仔癀對MCAO大鼠缺血側腦組織皮質NMDAR1、GluR2mRNA表達的影響Fig 3的qPCR結果顯示，與Sham組相比，MCAO組NMDAR1、GluR2 mRNA表達水平明顯降低(P<0.05，P<0.01)；與MCAO組相比，MCAO+PZH組NMDAR1、GluR2 mRNA表達水平明顯升高(P<0.05，P<0.01)。

3.4片仔癀對MCAO大鼠缺血側腦組織皮質NMDAR1和GluR2蛋白表達的影響Fig 4的Western blot結果顯示，與Sham組相比，MCAO組NMDAR1、GluR2 蛋白表達水平明顯降低(P<0.05)；與MCAO組相比，片仔癀預給藥組NMDAR1、GluR2蛋白表達水平明顯升高(P<0.05，P<0.01)，與mRNA呈現一致的變化趨勢。

Fig 3 Effects of PZH treatment on NMDAR1 and GluR2 mRNA in MCAO

#P<0.05,##P<0.01vssham;*P<0.05,**P<0.01vsMCAO

Fig 4 Effects of PZH treatment on NMDAR1 and GluR2 protein in MCAO

#P<0.05vssham;*P<0.05,**P<0.01vsMCAO

4 討論

腦缺血引發神經元損傷的發病機制較為復雜，涉及到復雜的時間和空間級聯反應。局部腦組織缺血缺氧，使得氧糖代謝和能量代謝受到阻礙，此過程持續一段時間后恢復血液供應，不僅未能及時恢復相應的功能，反而會出現更為嚴重的腦部損傷癥狀，稱為局灶性腦缺血/再灌注損傷。目前，關于腦缺血/再灌注損傷的病理生理機制主要有細胞能量耗竭、氧化應激、興奮性氨基酸毒性、鈣離子超載、炎癥反應、細胞凋亡等[11]。

研究發現，NMDAR是哺乳動物的中樞神經系統主要的興奮性神經遞質受體，可調節神經元的存活、樹突和軸突結構的生長和突觸新生與重塑、神經元環路的形成以及學習與記憶的活動[12]。NMDAR由NR1、NR2和NR3這3種不同亞基構成的陽離子通道。NR1作為NMDAR的主要功能亞基，在NMDA受體中可以單獨調節離子通道的開閉，在中樞神經系統中廣泛存在。在一定程度上，NMDAR可通過調控相應基因的表達，從而調節神經突觸的可塑性和神經興奮性毒性，是缺血性腦損傷中的重要離子通道調節受體[13]。研究表明，MCAO大鼠大腦缺血側腦組織皮質部分NR1 mRNA和蛋白表達明顯下降，片仔癀預先給藥后，抑制皮質的NR1 mRNA和蛋白表達的下降。說明片仔癀改善MCAO大鼠的神經功能缺損以及降低梗死體積，與其促進大鼠皮質NR1的表達有關。從我們的研究結果和已有文獻報道來看， NR1 mRNA及蛋白在MCAO大鼠中表達有升高與降低的兩種相反結果，這可能與激活的NMDAR位于突觸內或突觸外的位置有關，位于突觸外的NMDAR過度激活會導致興奮性毒性，而位于突觸內的NMDAR激活則可以促進細胞存活，提高干預治療的可能性[14]。

AMPAR是由GluR1～4四種亞基組成的多聚體，決定其對鈣離子通透性的關鍵分子是GluR2亞基。文獻指出[15]，腦缺血引起GluR2亞基表達降低，導致AMPAR由鈣不通透轉變為鈣通透，大量Ca2+通過已變構的AMPAR內流入神經元，最終促使興奮性氨基酸毒性的發生，以至于神經元死亡。本研究中，MCAO大鼠大腦缺血側腦組織皮質部分GluR2 mRNA和蛋白表達明顯下降，片仔癀預先給藥后，抑制了皮質的GluR2 mRNA和蛋白表達的下降。說明片仔癀對MCAO大鼠具有的保護作用，與其抑制大鼠皮質GluR2的表達下降有關。

綜上所述，預先給予一定量的片仔癀能有效改善MCAO大鼠的神經功能損傷，減少MCAO大鼠梗死體積，這可能與其促進NMDAR1、GluR2 mRNA及蛋白表達有關。

(致謝：本課題在福建中醫藥大學生物醫藥研發中心及福建省科技廳福建省中藥學重點實驗室完成，非常感謝福建中醫藥大學實驗動物中心對動物實驗的大力支持!)