鐵皮石斛提取物對潰瘍性結腸炎BALB/c小鼠的治療作用

趙 佩，劉志龍，高進賢，石 磊，于 靜，葛 斌，袁繼勇

(甘肅省人民醫院1.藥劑科、2.麻醉科，甘肅 蘭州 730000)

潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis，UC)是一種慢性復發性潰瘍，臨床表現出慢性復發性、持續性及難治性的特點，病因及病理機制尚不十分明確。大量研究表明，腸腔內各種抗原發生易位，并暴露于黏膜固有層的免疫系統，引起促炎細胞因子水平升高，抗炎細胞因子水平下降，導致級聯的免疫炎癥反應與UC有關[1]。目前,針對UC的治療藥物主要包括抗炎藥、皮質類固醇、生物制劑、免疫調節劑等，但長期使用可產生腹瀉、腹部疼痛不適等不良反應[2]，且這些治療方法并非對所有的UC患者均有效[3]。因此，治療UC的藥物開發依舊是研究熱點。鐵皮石斛為蘭科石斛屬草本植物，具有滋陰清熱、生津宜胃、潤肺止咳等功效，現代藥理研究表明，鐵皮石斛具有抗炎、增強機體免疫功能、抗氧化、降血糖等廣泛的藥理作用[4]。本研究以鐵皮石斛的抗炎及調節免疫作為切入點，通過檢測鐵皮石斛對UC小鼠炎性反應相關蛋白的影響，初次探討鐵皮石斛對UC小鼠的治療效應和作用機制，為進一步深入研究傳統中藥鐵皮石斛的藥用價值提供依據。

1 材料

1.1實驗動物健康SPF級BALB/c小鼠，♂，體質量18～20 g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，合格證號:SCXK(京)2016-0011。

1.2藥品與試劑鐵皮石斛購于上海第一制藥公司(批號:170122);5-氨基水楊酸(5-aminosalicylic acid，5-ASA)購于上海愛的發制藥有限公司(批號:160209)；葡聚糖硫酸鈉(dextran sodium sulfate，DSS),分子質量為36 000～50 000，美國MP Biomedicals公司產品；γ-干擾素(interferon γ，INF-γ)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)試劑盒，購于美國R&D公司(批號為E2000-1711-1、E2720-1710-3)；髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)抗體購自英國Abcam公司(貨號：ab31419)。

1.3儀器Eyela N-1100旋轉蒸發儀(日本Rikakikai有限公司)；Labofuge400R低溫離心機(德國Heraeus公司)；實時定量PCR儀、電泳儀(美國Bio-Rad公司)； UV-5600紫外可見分光光度計(上海元析儀器有限公司)；MR-96A酶標儀(深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司)。

2 方法

2.1鐵皮石斛提取物的制備根據文獻報道[5-6]，將鐵皮石斛在-80 ℃冷凍干燥成粉末，添加20倍質量體積的甲醇，不斷攪拌過夜提取兩次。用旋轉蒸發儀蒸發甲醇，并濃縮干燥提取物，最終得鐵皮石斛提取物浸膏粉末。

2.2模型的制備及給藥BALB/c ♂小鼠60只隨機分為6組，分別為正常組、DSS模型組、5-ASA(100 mg·kg-1)對照組、鐵皮石斛低、中、高劑量組(200、400、800 mg·kg-1)，每組10只，治療藥物劑量參考文獻報道[5-6]。適應性飼養1周，觀察無異常表現后再進行實驗,實驗前1 d，每組小鼠禁食不禁水24 h。參考文獻的造模方法，正常組自由飲用蒸餾水，其余各組自由飲用4% DSS溶液，連續7 d，誘導UC模型，d 8開始全部換成蒸餾水。造模d 1開始灌胃給藥，除正常組與模型組給予蒸餾水外，其余各組以0.02 mL·g-1體質量給予相應藥物，連續給藥10 d[7]。

2.3標本采集及處理末次給藥后，小鼠禁食24 h后眼眶取血，以3 000 r·min-1離心15 min,分離血清，置-20 ℃冰箱保存。取血完畢后處死小鼠，采集小鼠結腸組織，稱重并測量長度，沿腸系膜緣剪開腸腔，用生理鹽水沖洗腸內容物，剪成2段，中性甲醛溶液內固定，石蠟包埋進行常規病理切片、HE染色及免疫組化染色。

2.4指標檢測及方法

2.4.1外觀指標 造模前后及給藥后，觀察小鼠的精神及活動情況，記錄體質量。按照Tab 1的標準，每天計算各組小鼠疾病活動指數 (disease activity index，DAI)評分[8]。DAI=(體質量下降分數+腹瀉分數+便血分數)/3。

Tab 1 Criteria for disease activity index

a正常：成形大便；松散：不黏附于肛門的糊狀、半成形大便；腹瀉：可黏附于肛門的稀水樣便。

2.4.2病理學指標 HE染色的病理組織切片，按照周毅駿等[9]的標準進行評分，評分標準見Tab 2。

2.4.3血清中細胞因子測定 ELISA法測定各組小鼠血清中IFN-γ、TNF-α含量。取提前分離并冷凍保存的血清，放置室溫，嚴格按照IFN-γ、TNF-α檢測試劑盒說明操作。

2.4.4Real-time PCR測定小鼠遠端結腸中IFN-γ、TNF-α mRNA的表達 剪取小鼠遠端結腸組織約50 mg，用PBS沖洗，剪碎組織，加入500 μL TRIzol,研磨勻漿提總RNA,核酸微量定量儀檢測RNA純度及濃度后，應用反轉錄試劑盒(GoScriptTMReverse Tanscription System)將RNA反轉錄成cDNA，后用GoTaq qPCR Master Mix試劑盒進行熒光實時定量PCR反應。IFN-γ、TNF-α和內參β-actin的引物由上海生工生物工程有限公司設計、合成，引物序列見Tab 3。PCR的參數為:95 ℃預變性1 min，(95 ℃,10 s；60 ℃,20 s；72 ℃,20 s收集熒光)，共40個循環。實驗結果自動以Ct值給出。相對表達量按照2-ΔΔCt方法進行計算。反應完畢后，65～95 ℃,0.5 ℃·s-1將擴增的PCR產物做熔解曲線分析。

Tab 2 Criteria for assessment of microscopic colon damage

Tab 3 Primer sequence

2.4.5Western blot檢測結腸組織中MPO的表達 剪取小鼠結腸組織約50 mg，用PBS沖洗，剪碎并加入含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液500 μL,研磨勻漿提取蛋白,經BCA定量蛋白濃度后，進行SDS-PAGE電泳,蛋白轉印至活化的PVDF膜上,5%脫脂牛奶中室溫封閉2 h，MPO抗體(1 ∶500)4 ℃孵育過夜, TBST洗滌3遍,每遍10 min,加入二抗(1 ∶5 000)室溫孵育1 h，TBST洗滌3遍,每遍10 min，滴加ECL進行化學曝光，顯影、沖洗膠片并掃描分析，對目的條帶做灰度分析，以目的蛋白的灰度值比內參GAPDH的灰度值校正誤差，比較蛋白表達情況。

3 結果

3.1鐵皮石斛提取物對UC小鼠體質量、結腸長度的影響與對照組相比，模型組小鼠在造模d 2出現皮毛無光澤、食量減少和體質量減少的癥狀，d 3即出現不同程度的腹瀉、血便，這些癥狀此后不同程度加重。5-ASA和鐵皮石斛提取物治療組小鼠上述癥狀較模型對照組減輕，體質量減輕趨勢較緩和，且鐵皮石斛提取物800 mg·kg-1治療組體質量變化與模型對照組差異有顯著性(P<0.05)，見Fig 1A。處死小鼠后測量小鼠結腸長度(Fig 1B),模型對照組小鼠結腸變短，與正常對照組小鼠相比差異有顯著性(P<0.05)，而5-ASA和鐵皮石斛提取物不同劑量組小鼠結腸均較模型對照組長(P<0.05)。

Fig 1 Effects of D.officinale on body weight(A) and colon length(B) of ulcerative colitis

#P<0.05vsnormal group;*P<0.05vsmodel group

3.2DAI和病理學指標評估實驗過程中，對照組小鼠精神較好，食量、活動均無異常，皮毛有光澤，大便未出現血樣物。模型組小鼠在造模d 3后出現活動度下降，進食減少，部分小鼠出現稀便甚至腹瀉，肛周污穢黏膩，更嚴重的出現黏液膿血便，模型組小鼠DAI評分較正常對照組明顯升高(P<0.01)；鐵皮石斛提取物200、400 mg·kg-1組的小鼠給藥后較模型組一般情況有好轉，食量、活動量均改善，但個別小鼠有腹瀉，伴有體質量減輕，DAI評分與模型組比較降低(P<0.05)；鐵皮石斛提取物800 mg·kg-1組和5-ASA灌胃5 d后，小鼠活動情況較模型組好轉，偶有小鼠大便松散，體質量有所恢復，DAI評分較模型組明顯降低(P<0.01)，見Tab 4。

Fig 2、Tab 4結果顯示，鏡下觀察小鼠結腸組織，與正常小鼠結腸黏膜相比，模型組小鼠結腸黏膜有炎癥, 腸管增粗，黏膜層及漿肌層有大量中性粒細胞、淋巴細胞及漿細胞浸潤, 個別黏膜層明顯變薄。鐵皮石斛提取物高劑量組及5-ASA組鏡下小鼠結腸黏膜炎性浸潤、肌層病變較模型組有明顯減輕，組織學損傷評分與模型組相比差異有顯著性(P<0.01)；鐵皮石斛提取物低、中劑量組與模型組小鼠相比，腸壁與周圍組織有較輕組織黏連，隱窩結構基本完整，仍有部分炎性細胞浸潤，組織學損傷評分較模型組小鼠差異性較小(P<0.05)。

Fig 2 Effects of D.officinale on colon tissue damage of rats(HE, ×100)

A:Normal group;B: Model group; C:5-ASA group;D:D.officinale200 mg·kg-1group; E:D.officinale400 mg·kg-1group;F:D.officinale800 mg·kg-1group.

Tab 4 Scores of disease activity

##P<0.01vsnormal group;*P<0.05,**P<0.01vsmodel group

3.3鐵皮石斛提取物對小鼠血清IFN-γ、TNF-α含量的影響如Tab 5所示，正常對照組小鼠血清中IFN-γ、TNF-α的含量均較低，而模型組小鼠血清IFN-γ、TNF-α含量明顯增多(P<0.01，P<0.05)；5-ASA和鐵皮石斛提取物各劑量干預后，小鼠血清中IFN-γ、TNF-α含量均下降，IFN-γ含量減少明顯，與模型組相比，5-ASA和鐵皮石斛提取物中、高劑量組明顯降低血清IFN-γ含量(P<0.05)。TNF-α含量經陽性藥物治療后雖有下降，與模型組小鼠相比，無統計學差異，其與鐵皮石斛提取物也未表現出劑量依賴性，400 mg·kg-1的鐵皮石斛提取物明顯降低血清TNF-α含量(P<0.05)。

Tab 5 Effects of D.officinale on concentrations of IFN-γ, TNF-α after oral administration in UC

#P<0.05,##P<0.01vsnormal group;*P<0.05vsmodel group

3.4鐵皮石斛提取物對小鼠遠端結腸組織中IFN-γ、TNF-αmRNA表達的影響如Fig 3所示，經過DSS誘導的UC小鼠遠端結腸組織中IFN-γ、TNF- α mRNA的表達明顯高于正常小鼠(P<0.05)；經過鐵皮石斛提取物的干預治療，IFN-γ、TNF-α mRNA的表達呈下降趨勢，其中，IFN-γ mRNA表達下降與鐵皮石斛劑量有相關性，中、高劑量效果明顯(P<0.05)。而陽性藥物與鐵皮石斛提取物能夠抑制TNF-α mRNA的表達，但數據統計差異無顯著性。表明鐵皮石斛能有效抑制UC小鼠結腸組織中促炎因子IFN-γ mRNA的表達，減輕結腸炎癥反應。

Fig 3 Expression of IFN-γ, TNF-α mRNA by quantitative real-time n=10)

#P<0.05vsnormal group;*P<0.05vsmodel group

3.5鐵皮石斛提取物對小鼠結腸組織中MPO表達的影響如Fig 4所示，與正常組相比，模型組小鼠結腸組織中MPO蛋白表達明顯升高(P<0.05)；與模型組相比，5-ASA和鐵皮石斛干預各組，UC小鼠結腸組織中MPO蛋白表達明顯降低(P<0.05)，但并未呈現劑量相關性，中劑量的鐵皮石斛降低MPO蛋白表達效果較優。

Fig 4 Protein expressions of MPO in colon

#P<0.05vsnormal group;*P<0.05vsmodel group

4 討論

近年來，UC在全球的患病率呈持續上升的趨勢。盡管UC的病因和病理生理學尚不完全清楚，異常免疫反應在UC的發展中起著至關重要的作用[10]，它激活了結腸炎發病的標志物活性氧/氮物質(reactive oxygen species/reactive nitrogen species，ROS/RNS)生成系統，黏膜促炎性細胞因子(如IFN-γ、TNF-α、IL-1β、IL-6、COX-2等)過度產生，炎癥反應逐級放大，促炎細胞因子與抗炎細胞因子之間的平衡失調，導致了結腸組織的損傷。

化學誘導劑DSS誘導的小鼠UC模型在臨床癥狀、組織學和微觀方面與人類UC相似，具有很好的結腸損傷及腸上皮屏障破壞的發病特征，適合篩選UC及炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)潛在治療藥物[11]。我們以鐵皮石斛為目標藥物，它主要有效成分是石斛多糖、石斛堿等，有報道鐵皮石斛具有抗炎、增強機體免疫功能的藥理活性，可促進機體內外抗炎細胞因子的產生，并發揮調節免疫的作用[12]。結合鐵皮石斛的藥理活性和UC發病的異常免疫特點，本實驗考察鐵皮石斛提取物對UC小鼠的治療作用。

實驗研究顯示，鐵皮石斛提取物低、中、高劑量組對于UC臨床癥狀和腸道黏膜層顯示出了較好的保護和修復作用，腹瀉程度、疾病活動指數、黏膜充血水腫程度、中性粒細胞及炎性細胞浸潤、隱窩破壞程度均降低，提示鐵皮石斛提取物能降低炎癥的嚴重程度和范圍。在促炎因子中，IFN-γ、TNF-α是UC發病機制中的研究熱點，IFN-γ由NK細胞和Th1淋巴細胞產生，是典型的促炎因子，免疫調節活性強。而TNF-α作為腫瘤壞死因子家族的核心成員，是IBD中重要的調節因子，也是腸道上皮細胞增殖和凋亡的主要促炎因子，它也能激活中性粒細胞，誘導白三烯B4、O2、血小板激活因子等，導致UC患者腸黏膜微循環障礙。另外，TNF-α可增加粒細胞巨噬細胞集落刺激因子、內皮細胞MHC1類抗原、IL-1、IL-8的分泌，并促進中性粒細胞黏附內皮細胞，刺激局部炎癥反應。本研究結果表明，模型組中，血清促炎因子IFN-γ、TNF-α的表達明顯增高，與Abdin等[13]的報道一致，其表達與DAI和病理學組織評估結果相一致。且在基因表達水平，模型組TNF-α、IFN-γ mRNA表達明顯高于正常小鼠，經過鐵皮石斛提取物的干預治療，表達明顯下降，治療作用呈現劑量-效應關系。MPO是組織損傷和中性粒細胞浸潤的標志，先前的研究[14-15]已經證實，MPO的表達增高與中性粒細胞在腸上皮隱窩內和腸黏膜層內累積、浸潤所導致的結腸上皮損傷密切相關。本實驗結果中，鐵皮石斛提取物各劑量組結腸組織中MPO含量明顯低于模型組，說明鐵皮石斛能減輕中性粒細胞浸潤，改善結腸炎癥程度，起到黏膜保護作用。鐵皮石斛提取物對UC小鼠血清和結腸組織中IFN-γ、TNF-α、MPO表達的調控提示，其機制可能與下調促炎因子有關，且TNF-α能啟動NF-κB介導的反應，是其有效激活物，因此，也可考慮涉及了抑制NF-κB信號通路。

總之，本研究在動物實驗中初步證實了鐵皮石斛提取物對DSS誘導的UC的治療作用，其可能的機制為減少血清促炎因子IFN-γ、TNF-α的釋放，下調促炎因子IFN-γ、TNF-α、MPO的表達，阻斷炎癥的放大效應。關于鐵皮石斛治療UC的作用機制有待進一步深入研究。

(致謝：本實驗主要在蘭州大學第二醫院藥學部實驗室及甘肅省人民醫院科研中心完成，感謝課題組成員在整個實驗中所付出的勞動。)