基于尿液代謝組學的玉米須治療Ⅱ型糖尿病大鼠的作用機制研究

吳晨曦，董文婷，霍金海，王偉明

(黑龍江省中醫藥科學院中藥所分析室，黑龍江 哈爾濱 150036)

玉米須作為我國傳統中藥材之一，為禾本科植物玉米(StigmamaydisL.)的花柱和柱頭。《中華人民共和國藥典》中記載：玉米須味甘、淡、平，歸膀胱、肝、膽經，具有利濕退黃、降壓、利尿消腫等功效[1]?，F代藥理學研究表明，玉米須具有降血糖、利尿、降血脂、抗炎、提高免疫力等功效[2]。

糖尿病(diabetes mellitus, DM)的主要發病類型是Ⅱ型糖尿病(type 2 diabetes mellitus, T2DM)，它除了持久性高血糖外，常伴隨著脂肪、蛋白質代謝等代謝紊亂，也稱“代謝綜合征”，因此，DM患者容易發生感染、腎功能衰竭等并發癥，給人們的健康帶來嚴重的威脅[3]。代謝組學是一項多參數應答的、動態的新技術，主要利用現代分析技術定量測定生物體內源性小分子代謝產物，考察生物體在不同狀態下代謝產物的變化，通過整體分析代謝圖譜并結合模式分析，獲得相對應的生物標記物群，揭示了在特定環境下生物體的整體功能狀態[4]。

玉米須治療T2DM主要集中在某類成分降糖作用等方面的研究，但關于玉米須干預T2DM相關代謝組學研究尚未見報道。因此，本文通過建立T2DM大鼠模型，結合UPLC/Q-TOF-MS技術和多元統計比較分析方法，對玉米須治療前后T2DM大鼠尿液代謝產物進行分析鑒定，初步闡明玉米須治療T2DM的作用機制。

1 材料

1.1試劑鏈脲佐菌素(streptozocin，STZ)(批號：S0130，美國Sigma公司)；檸檬酸、檸檬酸鈉(分析級，西隴科學股份有限公司)；甲醇、乙腈(色譜級，Merck公司)；甲酸(色譜級，Fisher公司)；蒸餾水(廣州屈臣氏食品飲料有限公司)。

1.2試藥玉米須藥材于2017年9月采自黑龍江省農業科學院齊齊哈爾分院，經王偉明研究員(黑龍江省中醫藥科學院)鑒定為玉米須(StigmamaydisL.)。玉米須采用水煎煮方法提取濃縮，將干燥的玉米須剪短至2～3 cm，浸泡2 h，加10倍水煎煮2次，每次3 h，過濾，合并兩次濾液，于80 ℃水浴鍋中濃縮，冷卻后置于-20 ℃冰箱中待用，臨用時，加適量蒸餾水配成0.54 kg·L-1的溶液。

1.3實驗動物SPF級♂Wistar大鼠，體質量(200±20)g，由遼寧長生生物技術有限公司提供，動物許可證號：SCXK(遼)2015-0001。高糖高脂飼料，購于北京科奧協力飼料有限公司。大鼠飼養于黑龍江省中醫藥科學院動物實驗中心，自由取食、飲水，每天給予光照12 h，進行1周的適應性飼養后，開始實驗操作。

1.4儀器Exion LCTMUPLC超高效液相色譜系統、Triple TOF 5600+型質譜系統(配有ESI源及APCI源)(美國AB SCIEX公司)；BSA224S-CW型分析天平(賽多利斯科學儀器北京有限公司)；IVC-Ⅱ型代謝籠(蘇州市馮化實驗動物設備有限公司)；ST16R型低溫高速離心機(美國Thermofisher Scientific公司)；MDF-382E9(N)型超低溫冰箱(日本SANYO公司)；羅氏卓越型血糖儀及配套血糖試紙(美國羅氏診斷產品有限公司)。

2 方法

2.1動物造模及給藥參考文獻[3]，將Wistar♂大鼠42只，隨機分成空白組14只、模型組28只。空白組大鼠喂養基礎飼料，模型組大鼠給予高糖高脂飼料，喂養4周后，所有大鼠禁食16 h，模型組按35 mg·kg-1單次腹腔注射STZ，空白組則腹腔注射檸檬酸緩沖液。72 h后尾靜脈取血測定血糖，選取空腹血糖值大于16.7 mmol·L-1且持續1周不變者作為T2DM模型大鼠，不成模大鼠棄之。符合糖尿病模型的大鼠有20只，將其按血糖、體質量隨機分組，分為模型對照組(10只)和玉米須給藥組(10只)，空白對照組和模型對照組灌胃蒸餾水，給藥組灌胃玉米須提取物，給藥劑量根據玉米須臨床用量[5]，以2倍劑量換算成大鼠(200 g)的劑量是10.8 g·kg-1。連續給藥4周。

2.2血糖檢測造模成功后，每兩周為1個周期，所有大鼠禁食不禁水12 h，使用血糖儀及配套試紙測尾靜脈空腹血糖值。

2.3樣本采集和預處理給藥4周后，大鼠代謝籠收集12 h尿液。在此期間大鼠禁食不禁水。收集的尿液4 ℃、13 000 r·min-1離心10 min后，吸取上清液，后置于-80 ℃冰箱中保存備用，分析前解凍。

2.3.1尿液的質控樣本 取所有大鼠尿樣各200 μL，混勻，作為質控(quality control，QC)尿液樣品。取QC尿液樣品800 μL，分別加入800 μL水溶液稀釋至2倍，渦旋1 min，0.22 μm濾膜過濾，取續濾液進樣。

2.3.2尿液樣本 取大鼠尿樣各800 μL，分別加入800 μL水溶液稀釋至2倍，渦旋1 min，0.22 μm濾膜過濾，取續濾液進樣。

2.4尿液分析的色譜和質譜條件

2.4.1色譜條件 Waters Acquity UPLC HSS T3 C18色譜柱(1.7 μm, 2.1 mm×100 mm)，AQUITY UPLC HSS T3 C18VanGuard Pre-Column 預柱(1.7 μm, 2.1 mm×5 mm)，柱溫30 ℃。進樣量5 μL，自動進樣器溫度設為4 ℃，流速0.3 mL·min-1。流動相梯度洗脫見Tab 1。

Tab 1 Mobile phase gradient elution

2.4.2質譜條件 采用電噴霧離子源(ESI)，正、負離子模式采集數據，質譜參數設定見Tab 2。掃描方式：IDA，響應值在100 cps以上的8個最高峰進行二級質譜掃描，并扣除動態背景(DBS)。數據采集軟件是Analyst TF 1.6 software工作站。

Tab 2 Mass spectrometer settings

3 結果

3.1大鼠一般觀察造模后的大鼠出現活動減少、體毛疏松現象，飲食量和飲水量、尿量明顯增加，而體質量明顯減輕(P<0.01)，出現明顯的“三多一少”癥狀?？瞻捉M大鼠體質量持續增加，模型鼠體質量降低，經過玉米須給藥治療后，這些癥狀得到了明顯的改善，并且體質量出現了逐步增加的現象。見Tab 3。

Tab 3 Weight value of rats in each group(g,

##P<0.01vsblank control;*P<0.05vsmodel

3.2血糖檢測結果Tab 4結果顯示，大鼠造模后，與空白對照組相比，模型組空腹血糖值明顯升高(P<0.01)；與模型組相比，給藥2周后，玉米須給藥組大鼠血糖值明顯降低(P<0.01)。

Tab 4 Blood sugar of rats in

##P<0.01vsblank control;**P<0.01vsmodel

3.3大鼠尿液代謝組學分析

3.3.1系統穩定性 為確保保留時間(tR)和質荷比(m/z)的穩定性等，在UPLC/Q-TOF-MS檢測過程中，每檢測8個樣本，選擇進1次QC樣本。Fig 1是正負離子模式下系統穩定性檢測的結果，QC樣本聚類明顯。結果表明，系統在檢測過程中很穩定，所得到的數據可靠。

3.3.2大鼠尿液代謝輪廓分析 為了考察玉米須水煎液對T2DM模型大鼠內源性代謝物的影響，將UPLC/Q-TOF-MS采集的所有尿液樣品數據導入Waters Progenisis QI軟件進行PCA分析(Fig 1)。由圖可知，空白對照組、模型組及玉米須給藥組組內聚類較好，組間有明顯的離散，說明經玉米須干預后，玉米須給藥組對模型組有干擾作用。

為了進一步區分各組差異，對空白對照組、模型組和玉米須給藥組尿液代謝物進行有監督的PLS-DA分析，其中正離子模式下模型的評價指標為R2X=0.96，Q2=0.86，負離子模式下模型的評價指標為R2X=0.98，Q2=0.94，見Fig 2。結果顯示，所建立的模型有效，模式質量良好，可用于后續的組間差異成分的尋找與分析，并且模型組與給藥組有明顯的分開。

Fig 1 PCA score plot in positive ion mode(A) and negative ion mode(B)

K:Blank control group; M: Model group; YZ: Treatment group of corn; QC: System stability.

3.3.3潛在生物標志物的表征 采用正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)方法，對空白對照組、模型組及模型組、玉米須給藥組大鼠尿液代謝輪廓數據分別進行分析(Fig 3、4)，獲得能夠直觀反映對代謝輪廓軌跡變化貢獻率的S-Plot(Fig 5、6)。在S-Plot中，依據載荷圖中距離原點越遠，離子對代謝輪廓軌跡產生變化的貢獻越大。將變量重要投影值(VIP>1)、t檢驗(P<0.05)以及Fold Change≥2的代謝物視為差異性代謝物，查閱相應的數據庫(KEGG/HMDB)，結合質譜信息對選出的差異性代謝物進行鑒定、識別。在正、負離子模式下，分別篩選出6個和6個差異性標志物。見Tab 5、6。

3.4代謝通路分析由Tab 5、6可見，在12個核心標志物中，模型組含量均與空白對照組差異有顯著性，給藥后，均有回調趨勢。將正負離子模式下得到潛在生物標志物導入到Human Metabolome Database(HMDB)和Kegg Compound Database(KEGG)數據庫中，對這12個標志物可能的代謝通路進行分析。

Tab 5 Identification of differences in markers of positive ion mode

##P<0.01vsblank control group A;**P<0.01vsmodel group B.↓: decrease; ↑: increase. The same as below.

Tab 6 Identification of differences in markers of negative ion mode

#P<0.05，##P<0.01vsblank control group A;*P<0.05，**P<0.01vsmodel group B

Fig 2 PLS-DA plot in positive ion mode(A) and negative ion mode(B)

K:Blank control group;M:Model group;YZ:Treatment group of corn;QC:System stability.

Fig 3 OPLS-DA plot in positive ion mode(A) and negative ion mode(B)

K:Blank control group; M: Model group.

Fig 4 OPLS-DA plot in positive ion mode(A) and negative ion mode(B)

M: Model group; YZ: Treatment group of corn.

3.4.1氨基酸代謝 生物體內大部分膽固醇(75%～85%)可在肝臟轉變鵝去氧膽酸(chenodeoxycholic acid)和甘氨膽酸(glycocholic acid)，鵝去氧膽酸和膽酸分別與甘氨酸或?；撬峤Y合，生成初級結合膽汁酸。膽汁酸隨膽汁分泌進入小腸，大部分被腸黏膜重吸收，經門靜脈返回肝臟，再排泄至腸道，即膽汁酸的“腸肝循環”，其中只有少部分隨糞便排出體外。所以正常情況下，尿液中含有少量膽汁酸，若腸肝循環被破壞，血清中的膽汁酸含量就會明顯升高，而此時生成膽汁酸的限速酶下降至15倍，尿液中膽汁酸含量就會增加。本實驗結果發現，鵝去氧膽酸和甘氨膽酸含量在T2DM模型組中明顯升高(P<0.05)，而在玉米須給藥組中明顯降低(P<0.05)，較模型組分別降低15.54%和16.01%。這主要是因為T2DM模型鼠體內血糖含量過高，使

Fig 5 S-plot in positive ion mode(A) and negative ion mode(B)

K:Blank control group; M: Model group.

Fig 6 S-Plot in positive ion mode(A) and negative ion mode(B)

M:Model group; YZ: Treatment group of corn.

糖代謝和脂代謝發生異常，肝臟攝取膽汁酸功能發生障礙，膽固醇在肝內轉化率下降并蓄積，使腸肝循環受到破壞，尿中的甘氨膽酸和鵝去氧膽酸含量明顯升高，而玉米須可使糖代謝及脂代謝趨于正常[6]。

色氨酸代謝與免疫調節功能及機體神經內分泌有密切關系，可能與DM發生有關[7]。5-羥基吲哚乙酸(5-hydroxyindoleacetic acid，5-HIAA)是5-羥色胺(5-HT)的主要代謝產物。而5-HT是由體內色氨酸經羥化和脫羧作用生成，其中未被利用的5-HT經單胺氧化酶轉化為5-HIAA，從尿液排出體外，同時4,6-二羥基喹啉(4,6-dihydroxyquinoline)也是色氨酸代謝產物之一。實驗發現，T2DM鼠尿液中5-HIAA含量明顯升高(P<0.01)，4,6-二羥基喹啉含量明顯降低(P<0.01)，表明大鼠體內發生了色氨酸代謝紊亂。而玉米須給藥組大鼠尿液中5-HIAA含量明顯降低(P<0.01)，4,6-二羥基喹啉含量明顯升高(P<0.01)，表明玉米須可以改善色氨酸代謝。

3.4.2糖代謝 乳酸(lactic acid)大部分是由肌肉糖酵解生成的，經血液運輸到腎臟或肝臟，再經過糖異生形成葡萄糖。安靜的狀態下產生的乳酸的量很少，只有在某些生理或病理狀態下，肌糖原酵解產生大量的乳酸，由血液運輸到肝臟，形成葡萄糖。在模型鼠中，乳糖(lactose)、乳酸含量明顯升高(P<0.01)，推測原因可能與糖酵解有關。正常生理條件下，糖異生的主要器官是肝臟，當肝臟受到損傷，乳酸代謝發生障礙，導致乳酸堆積，最終使尿中乳酸含量升高[8]，而經玉米須治療后，發現乳糖、乳酸含量明顯降低(P<0.01)，提示玉米須可以通過保護肝臟來降低血糖。

精氨琥珀酸(argininosuccinic acid)是由精氨酸代琥珀酸裂解酶催化裂解為延胡索酸和精氨酸，生成的延胡索酸再進入TCA循環中，而TCA循環是糖、脂和氨基酸的最終代謝通路。模型鼠中精氨琥珀酸含量異常升高可能是精氨酸代琥珀酸裂解酶下調所致，表明可能因為缺乏底物參與而使TCA循環減弱。經過玉米須治療后，大鼠尿液中的精氨琥珀酸含量明顯下降(P<0.01)，較模型組下降了62.24%，說明玉米須可能參與了TCA循環[9]。

3.4.3其他 酮體(丙酮、β-羥丁酸、乙酰乙酸)是脂肪酸在肝臟分解氧化時所特有的中間代謝產物。正常情況下，糖的氧化是生物體主要的能量來源，此時脂肪動員較少，因而血中酮體含量也很少(約在0.05～0.85 mmol·L-1)。但當血中含糖量過高，糖氧化供能降低，脂肪酸轉化為大量的酮體，超過肝外組織利用分解酮體的能力，血中和尿中出現大量酮體。本實驗結果發現，T2DM模型組尿液中(R)-3-羥基丁酸[(R)-3-hydroxybutyric acid]含量明顯升高(P<0.05)，而玉米須給藥組含量則明顯降低(P<0.05)。這可能與玉米須調節酮體生成有關[10]。

白三烯是花生四烯酸(arachidonic acid，AA)通過脂質氧化酶途徑產生的重要產物之一，AA通過脂氧化酶代謝為氧化二十烯酸(5-HPETE)，在水解酶或谷胱甘肽-5-轉移酶(GST)的作用下，轉為二羥酸LTB4[11]。GST酶被證實可以通過結合氧化物質底物，從而保護細胞避免氧化損傷[12]。故有研究表明，谷胱甘肽S-轉移酶M1(GSTM1)基因缺失易發生DM[13]。同時，DM也被認為是全身炎癥性疾病[14]，而白三烯B4(leukotriene B4，LTB4)是體內重要的炎癥調節因子。本實驗結果發現，模型鼠尿液中LTB4含量明顯降低(P<0.01)，玉米須給藥組LTB4水平明顯升高(P<0.01)，可能原因是玉米須水煎液可以增強GST轉移酶活性，抗氧化活力增強，LTB4生成量增加，產生抗炎作用，提示玉米須水煎液具有抗氧化和抗炎作用。

4 討論

DM是一種常見的受多種因素影響，且具有遺傳傾向的內分泌代謝性疾病，以血糖升高為主要表現，并伴隨糖、脂、能量、氨基酸等代謝紊亂，以及氧化應激狀態，從而對肝腎功能有一定的損傷[15]。代謝組學能將內源性小分子代謝物相關信息與疾病的生理病理狀態聯系起來，從整體揭示內分泌代謝性疾病(如糖尿病)的發病機制，并能體現中藥多靶點綜合性作用特點。因此，利用代謝組學方法研究中藥治療T2DM及其并發癥的研究已成為研究熱點。本實驗結果發現，玉米須水煎液能明顯改善DM“三多一少”的臨床癥狀，對體質量的改善尤為明顯，并可以明顯降低T2DM大鼠的血糖值。通過將尿液代謝譜進行多元統計分析，發現模型組大鼠糖代謝、脂肪代謝、氨基酸代謝等多條代謝途徑發生紊亂，玉米須對這些代謝途徑中chenodeoxycholic acid、5-HIAA、(R)-3-hydroxybutyric acid、argininosuccinic acid、arachidonic acid、4,6-dihydroxyquinoline、LTB4等具有回調作用，提示其降糖作用機制可能與改善糖、脂及氨基酸等代謝紊亂有關，為尋找玉米須降糖作用靶點提供了科學依據。