滇結香花中5種化學成分對四氯化碳肝損傷小鼠的保護作用

南彩云，鐘國躍，朱繼孝，楊 雯，李輝虎，張風波，張博文，李 敏

(江西中醫藥大學中藥資源與民族藥研究中心，江西 南昌 330004)

滇結香花為瑞香科結香屬植物滇結香[Edgeworthiagardneri(Wall.) Meisn.]的干燥花蕾，民間常用于青盲、翳障、多淚、羞明等眼部疾患[1]。課題組的前期研究表明，滇結香主要含有黃酮類、香豆素類、有機酸類等化合物，其60%乙醇提取部位具有良好的抗四氯化碳(CCl4)誘導的小鼠肝損傷作用[2]，并從中分離得到了12個成分。研究發現[3-4]，西瑞香素具有較好的抗腫瘤作用，對二甲苯引起的小鼠耳廓腫脹及雞蛋清引起的大鼠足跖腫脹有較好的抑制作用。Nurgun等[5]研究表明，銀鍛苷對卡拉膠誘導的腳掌水腫，具有較強的抑制作用。Yan等[6]發現，結香苷C對于冰醋酸法致痛覺模型具有較強的鎮痛作用，但均未有關于肝保護作用方面的研究。本研究對分離得到的5種宏量化合物西瑞香素、水楊酸、結香苷C、銀鍛苷、紫云英苷進行了小鼠體內實驗，以探討滇結香保肝活性成分物質及其可能的作用機制。

1 材料

1.1藥品與試劑聯苯雙酯滴丸，購自浙江萬邦藥業股份有限公司，批號：A02151219；西瑞香素、水楊酸標準品，購自南京道斯夫生物科技有限公司；紫云英苷標準品，購自成都德斯特生物技術有限公司；結香苷C、銀鍛苷均為實驗室自制，純度達98%；谷丙轉氨酶(alanine aminotransferase,ALT，批號：20170614)、谷草轉氨酶(aspartate aminotransferase, AST，批號：20170614)、丙二醛(malondialdehyde，MDA，批號：20170607)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD，批號：20170612)測定試劑盒，均購自南京建成生物工程研究所；動物組織總RNA提取試劑盒、D2000 DNA Marker(天根生化科技有限公司)；反轉錄試劑盒(批號：0000228426)、GelRedTM1000×in water(Promega公司)；Tap PCR Green Mix(北京鼎國生化有限公司)；TNF-α、IL-6、GAPDH引物，均由北京鼎國生化有限公司合成。

1.2儀器高速冷凍離心機(美國Beckman-Coulter公司)；Multiskan GO全波長酶標儀(美國Thermo公司)；紫外分光光度計UV-1800(日本島津有限公司)；DY89-II電動勻漿機(寧波新芝生物科技股份有限公司)；凝膠成像儀(美國Bio-Rad公司)；TKY-BMB型石蠟包埋機、包埋專用冷臺(湖北省泰康醫療設備有限公司)；半自動輪轉式切片機 RM2245(北京長恒榮創科技有限公司)；XI15正置顯微鏡(日本奧林巴斯有限公司)。

1.3實驗動物130只昆明種成年♂小鼠，SPF級，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，許可證號：SCXK(湘)2016-0002。實驗室溫度(24±2)℃，相對濕度(50±2)%。

2 方法

2.1小鼠分組及給藥130只小鼠(20～30 g)隨機分成13組，每組10只。分別為空白對照組、模型組、聯苯雙酯組(陽性對照組)、紫云英苷低、高劑量組(ZL、ZH)，西瑞香素低、高劑量組(XL、XH)，結香苷C低、高劑量組(JL、JH)，水楊酸低、高劑量組(SL、SH)，銀鍛苷低、高劑量組(YL、YH)。參考文獻[7]并結合預實驗，確定各個給藥組低、高劑量組給藥劑量為50、100 mg·kg-1，聯苯雙酯組的劑量為150 mg·kg-1。各個藥物分別混懸于0.5%的羧甲基纖維素鈉溶液中，連續給藥7 d，空白對照組和模型組給予相應體積的生理鹽水。

2.2模型建立以CCl4誘導小鼠急性肝損傷模型。d 6給藥1 h后，腹腔注射0.2% CCl4花生油溶液10 mL·kg-1。空白對照組給予相應體積的花生油。造模后，禁食不禁水，16 h后給藥1次，1 h后眼眶取血，全血5 000 r·min-1、4 ℃離心10 min，取血清置于4 ℃冰箱備用。小鼠斷頸脫臼處死，并于冰臺快速分離相同部位肝臟組織2份，其中一份10%甲醛固定，另一份取出后置于-70 ℃冰箱備用[8]。

2.3生化指標的測定將離心后的血清取出，用酶標儀按試劑盒測定ALT、AST等指標。取左葉肝臟組織0.1 g，以生理鹽水為溶劑，制備成10%的肝組織勻漿，3 000 r·min-1離心10 min，取上清液，采用測試盒比色皿法，分別測定SOD、MDA的含量。

2.4肝組織病理學檢測取10%甲醛固定好的肝臟大葉，常規石蠟包埋、切片、HE染色，并于光鏡下觀察拍照。

2.5肝組織TNF-α、IL-6mRNA表達的檢測每組取15 mg左右肝組織樣品，共13組，按照RNA動物組織提取試劑盒說明書提取肝組織總RNA，1.2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA純度。取4 μL總RNA，進行反轉錄，合成cDNA。所用引物序列信息[9-11]見Tab 1。PCR反應體系總體積為50 μL，GAPDH基因PCR擴增條件為94 ℃預變性3 min，94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循環28次，72 ℃終止10 min；TNF-α基因PCR擴增條件為94 ℃預變性3 min，94 ℃變性45 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，循環34次，72 ℃終止10 min；IL-6基因PCR擴增條件為94 ℃預變性3 min，94 ℃變性45 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循環35次，72 ℃終止7 min。PCR擴增產物經1.2%瓊脂糖凝膠電泳及Biotium GelRed染液染色，凝膠影像分析儀分析，以GAPDH為內參對照，目的mRNA與GAPDH的RT-PCR產物的吸光度值比值作為目的mRNA相對表達量。

3 結果

3.1對CCl4肝損傷小鼠肝勻漿SOD、MDA活性及血清ALT、AST水平的影響Tab 2結果顯示，與空白對照組相比，小鼠肝組織勻漿中SOD含量明顯降低，MDA含量明顯上升，小鼠血清中ALT、AST水平明顯增高，差異均有統計學意義(P<0.01)，表明造模成功。與模型組相比較，各給藥組小鼠肝組織勻漿中SOD含量明顯升高，MDA含量明顯降低(P<0.01，P<0.05)；縱向比較血清中生化指標，ZH、SH、JL、JH、XH、YH各給藥組ALT水平均有明顯降低，差異具有顯著性(P<0.01，P<0.05)，ZL、SL、XL、YL給藥組ALT水平雖有所降低，但差異無顯著性(P>0.05)，ZH、SH、JL、JH、XL、XH、YH各給藥組的AST含量明顯降低，差異具有統計學意義(P<0.01，P<0.05)，ZL、SL、YL給藥組AST含量雖有所降低，但差異無統計學意義(P>0.05)。

3.2肝臟組織病理學變化如Fig 1所示，正常組肝小葉結構完整，肝細胞形態正常，肝細胞索排列整齊，細胞連接緊密；模型組肝細胞水腫，肝細胞彌漫性變性，肝竇變窄，有大量的炎性細胞浸潤，甚至出現細胞壞死；陽性對照組肝細胞與模型組相比較，細胞狀況明顯改善，少量炎性細胞浸潤；ZH、SH、JL、JH、XH、YH各給藥組肝細胞結構有明顯改善,肝細胞脂肪變性明顯減輕,炎性細胞浸潤、壞死程度明顯減輕，受損面積明顯變小；ZL、SL、XL、YL給藥組肝細胞肝索排列紊亂，肝小葉可見大量肝細胞壞死,細胞膜溶解消失或碎裂，細胞核有明顯聚集現象，與模型組對比，無明顯改善。

Tab 1 Information of PCR primers

Tab 2 Effects of different compounds on activity of SOD, MDA and levels of serum ALT, AST on carbon tetrachloride-induced liver injury in

*P<0.05,**P<0.01vsnormal;#P<0.05,##P<0.01vsmodel

Fig 1 Effects of different compounds on carbon tetrachloride-induced liver injury tissue in mice(HE, ×200)

3.3對肝組織TNF-α、IL-6mRNA表達的影響如Fig 2所示，CCl4引起的小鼠急性肝損傷使TNF-α、IL-6 mRNA的表達明顯增加，亦能表明實驗造模成功。各不同單體化合物及不同給藥劑量組對TNF-α、IL-6 mRNA的表達結果顯示： 除ZL給藥組外，其他給藥組均可明顯抑制TNF-α mRNA的表達，而且JL、JH、ZH組的抑制作用與陽性對照組作用相當；不同給藥組中，除YL、ZL、XL組外，其他給藥組均可明顯抑制IL-6 mRNA表達，且JL、JH、ZH、XH給藥組與陽性對照組比較，差異無顯著性。

4 討論

CCl4是經典的誘導肝損傷動物模型的化學物質，該動物模型具有指標明確、重復性好等優點。其誘導機制主要為當肝臟受到損傷時，肝細胞內酶大量釋放到血液，導致血內ALT、AST等酶含量明顯升高，故血清中ALT、AST的含量高低可在一定程度上反映出肝細胞損傷程度。CCl4進入體內經肝微粒體細胞色素P450代謝，可引起脂質過氧化作用，并形成脂質過氧化物MDA，SOD作為機體內天然存在的超氧自由基清除因子之一，可有效清除由CCl4作用產生的自由基，MDA、SOD的含量高低可反映肝細胞的修復程度[12]。本研究采用小鼠CCl4肝損傷經典模型，試劑盒測定血清中ALT、AST含量及肝勻漿中MDA、SOD的含量，對5種成分進行了保肝活性評價。結果表明，與模型組比較，ZH、SH、JL、JH、XH組血清中ALT、AST水平明顯降低，結合各個給藥組病理切片，說明該5組給藥組能增強肝細胞抗損傷能力，增加膜結構的穩定性，對肝臟有一定的保護作用。肝組織中MDA含量降低，SOD含量升高，提示該5組實驗組具有增強肝臟抗氧化能力、減少脂質過氧化物生成的作用。其中，結香苷C(JL、JH)給藥組與陽性對照組實驗效果相近，作用最佳，可能為滇結香保肝作用的主要有效成分之一。

Fig 2 Effect of different compounds on expressions of TNF-α, IL-6 mRNA in mouse

1:Normal; 2: Model; 3: Positive; 4: YL; 5: YH; 6: ZL; 7: ZH; 8: SL; 9: SH; 10: JL; 11: JH; 12: XL; 13: XH.**P<0.01vsnormal;#P<0.05,##P<0.01vsmodel.

本研究從分子水平對5種成分的保肝活性及其作用機制進行了探討。觀察TNF-α、IL-6 mRNA的表達水平，探究各成分的肝保護作用及其可能的作用機制。TNF-α是一種主要由單核巨噬細胞分泌的具有多種生物活性的多肽調節因子。CCl4可激活枯否氏細胞產生TNF-α等促炎細胞因子，這些炎性介質的釋放可活化中性粒細胞，通過自分泌或旁分泌作用，激活免疫細胞和炎性反應信號通道[13]，誘導其他炎性因子如IL-6 mRNA的表達，進一步產生氧自由基，加重炎性反應[14]。IL-6是白介素家族的成員，由巨噬細胞、單核細胞及淋巴細胞等炎癥細胞產生的促炎癥細胞因子[15]，可使T、B細胞及NK細胞廣泛激活，誘導其他炎性介質的產生，從而加劇和促進局部炎癥的形成。實驗結果顯示，CCl4能明顯促進TNF-α、IL-6 mRNA的表達，結合組織病理切片及血清、血漿指標，與模型組比較，表明ZH、SH、JL、JH、XH、YH組可有效抑制TNF-α、IL-6 mRNA的表達，降低血清、血漿中TNF-α和IL-6的含量，且JL、JH、YH給藥組具有下調TNF-α、IL-6 mRNA表達的作用，與陽性對照組相比較，差異無顯著性，表明其可能是通過調節機體免疫功能而降低CCl4引起的肝損傷。

綜上，ZH、SH、JL、JH、XH、YH給藥組可降低肝勻漿中MDA的含量，提高SOD的生物活性，降低血清中ALT、AST的含量，以及抑制肝組織中TNF-α mRNA和IL-6 mRNA的表達，可能是通過調節小鼠的免疫功能，增強肝臟抗氧化能力，減少脂質過氧化物生成，從而達到緩解、降低小鼠肝損傷的效果。前期研究表明，滇結香60%乙醇提取部位對CCl4致急性肝損傷小鼠具有較好的保肝作用，其降ALT、AST作用優于陽性對照聯苯雙酯組[3]。本次實驗中所考察的單體藥物均來自于該部位，結果顯示，ZH、SH、JL、JH、XH、YH給藥組均具有良好的保肝作用，但降ALT、AST作用均弱于60%乙醇提取部位，提示該部位中可能還存在保肝活性更強的微量成分，或各成分之間存在協同作用，還有待進一步研究。