越鞠丸對皮質酮模型小鼠抑郁樣行為和神經新生的影響

馬 瑤，周 童，張海樓，嚴瑤瑤，王 薇，薛文達,4，王福順

(南京中醫藥大學1. 基礎醫學院轉化系統生物學和神經科學研究中心，中醫腦病重點實驗室，2. 醫學與生命科學學院，3. 心理學院，江蘇 南京 210023；4. 南通大學神經再生協同創新中心，江蘇 南通 226001)

抑郁癥是由神經再生和神經內分泌功能障礙引起的精神健康障礙[1]，主要表現為心情低落、失去興趣等，常伴有自殺傾向，危害人類健康。眾多研究表明，抑郁、焦慮和其他情感障礙疾病都與皮質酮水平有關[2]。長期給予嚙齒類動物過量皮質酮能夠誘導產生抑郁焦慮樣行為，高濃度的糖皮質激素(嚙齒類動物為皮質酮)會結合大量受體，并引起海馬腦區功能異常，從而導致焦慮、抑郁等情緒疾病發生[3]。因此，給予糖皮質激素對神經造成的損傷通常可以作為研究應激對神經損傷的抑郁模型。

應激能夠抑制海馬中神經新生的水平，促進焦慮和抑郁的病程發展[4]。Duan等[5]研究表明，通過建立抑郁模型，神經新生水平下降，而經過抗抑郁治療能夠促進神經新生。近來研究表明，行為學的缺陷和海馬齒狀回(dentate gyrus，DG)細胞增殖的減少是由于皮質酮水平改變造成的，而這一現象可以被單胺類抗抑郁藥物所逆轉[6]。這些結果提示，海馬神經新生是抗抑郁藥物發揮治療作用的重要分子機制之一。

目前，臨床上用于治療抑郁癥的藥物大多起效緩慢。越鞠丸出自《丹溪心法》，由梔子、蒼術、香附、川芎、神曲5味藥組成，是治療郁證的經典方。前期研究發現，越鞠丸醇提物具有快速起效的抗抑郁作用，cAMP依賴蛋白激酶(cAMP-dependent protein kinase, PKA)和環磷腺苷效應元件結合蛋白(cAMP-response element binding protein, CREB)參與了越鞠丸的快速抗抑郁作用[7]。細胞外調節蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases, ERK)則在cAMP/PKA/CREB信號通路中也起到重要的調節作用。但越鞠丸是否作用于海馬神經新生仍不清楚。本研究擬采用行為學方法，檢驗越鞠丸對皮質酮誘導抑郁模型小鼠的抗抑郁效果，結合免疫組化及Western blot技術，檢測越鞠丸對海馬神經新生及PKA-ERK-CREB信號通路蛋白表達的影響，進而探討越鞠丸通過神經新生產生抗抑郁作用的分子機制。

1 材料

1.1實驗動物SPF級C57BL/6N小鼠，♂，7～8周齡，體質量20～24 g，購自常州卡文斯實驗動物有限公司，動物合格證號：SCXK(蘇)2016-0010。實驗前，小鼠適應飼養環境1周，環境溫度20～24 ℃，濕度40%～60%，晝夜交替時間12 h，動物自由攝食飲水。

1.2藥物與試劑實驗用越鞠丸，購自江蘇七零七天然制藥有限公司成品藥(批號170401)，將藥丸用粉碎機粉碎，按0.2 kg·L-1與生理鹽水充分混合后，超聲1 h，放入4 ℃冰箱保存備用。皮質酮(corticosterone，CORT，批號：95H0092)，購自美國Sigma公司；蔗糖(國藥集團化學試劑有限公司)；RIPA裂解液(Beyotime，貨號：P0013B)；蛋白酶抑制劑Cocktail(貨號：5871S)、一抗PKA(貨號：5842)、CREB(貨號：9197)、p-CREB(貨號：9198)、ERK(貨號：9102)、p-ERK(貨號：4376)，均購自CST公司；β-tubulin(Epitomics，貨號：1879-1)；Ki67抗體(Proteintech，貨號：27309-1-ap)；ECL顯色液(康為世紀，貨號：2514K)。

1.3儀器動物行為分析系統(美國Any-maze公司)；純水機(美國Millipore公司)；電泳轉膜儀(美國Bio-Rad公司)；Tannon-5200全自動化學發光圖像分析系統(上海天能科技有限公司)；CM1950冰凍切片機(德國Leica公司)；BX51型顯微鏡(日本Olympus公司)。

2 方法

2.1皮質酮誘導抑郁小鼠模型的建立及越鞠丸給藥實驗小鼠隨機分為3組：空白對照組(Con)、模型+生理鹽水組(Mod)、模型+越鞠丸組(YJ)。其中，模型組和越鞠丸組按照20 mg·kg-1的劑量皮下注射皮質酮混懸液(皮質酮先溶于DMSO中，然后加生理鹽水配成2 g·L-1混懸液，超聲振蕩混勻)，連續給藥4周；空白組注射等體積生理鹽水。越鞠丸組在造模第4周時，同時進行中藥灌胃[8]。

2.2行為學測試

2.2.1糖水偏好測試 造模前，給予實驗小鼠質量分數為2%的蔗糖溶液進行適應。禁水16～18 h后，將小鼠單籠放置。給予小鼠2%蔗糖溶液、純凈水各1瓶，2 h后觀察蔗糖消耗量。蔗糖消耗百分比計算公式為：蔗糖消耗=[(蔗糖消耗量)/(蔗糖消耗量+純水消耗量)]×100%。

2.2.2懸尾測試 將小鼠尾部貼在鉤子上，倒掛在測試箱內，用攝像機記錄6 min小鼠的行為，記錄后4 min內小鼠的不動時間。

2.2.3陌生環境攝食測試 小鼠禁食24 h后，將其從固定一角放入一個新的測試箱內，測試箱中心放置預稱量的糧食。攝像機記錄10 min。觀察小鼠首次進食的潛伏時間以及單位時間的攝食量。記錄潛伏期和消耗食物的重量。單位時間攝食量計算公式：單位時間攝食量/g= 10 min內消耗糧食重量(g)/小鼠體質量(g)。

2.3免疫組化法檢測Ki67+細胞數量實驗小鼠用質量分數為3.5%的水合氯醛麻醉，開胸，先灌注生理鹽水，再用質量分數為4%的多聚甲醛灌注固定，取腦。質量分數為4%的多聚甲醛固定1 d，質量分數為30%的蔗糖脫水，冰凍切片(厚度為30 μm)，PBS漂洗3次，4 ℃冰箱備用。臨用時，用PBS洗腦片3次，室溫封閉1 h后，再用PBS洗1次，加入Ki67抗體，1 d后吸出一抗，用PBS洗3次，加入二抗(1 ∶1 000)，避光孵育1 h，PBS洗3次。貼片后顯影。觀察并計數各組小鼠海馬DG區Ki67+細胞數。

2.4Westernblot法檢測蛋白表達水平Western blot法檢測PKA、ERK及CREB的表達水平。實驗小鼠取腦部海馬組織，提取蛋白并測定濃度。電泳分離蛋白質，濕轉法將蛋白轉至PVDF膜上。轉膜后，用3% BSA于室溫封閉膜1 h，分別加入PKA、CREB、p-CREB、ERK、p-ERK及β-tubulin的抗體，4 ℃孵育過夜。用TBST漂洗3次，各10 min，再將洗好的PVDF膜放入二抗孵育1 h。用TBST漂洗3次，各10 min，加入ECL發光底物后顯色。采用全自動化學發光圖像分析系統顯影分析。采集目的蛋白與內參β-tubulin灰度值，得到各樣本蛋白的灰度比值。

2.5統計學分析所有數據均用SPSS 20.0統計分析軟件進行分析，多組數據間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)。

3 結果

3.1越鞠丸給藥能夠逆轉皮質酮誘導產生的小鼠抑郁樣行為通過給予皮質酮構建小鼠抑郁模型，在造模最后1周每天灌胃越鞠丸(2 g·kg-1)，造模結束后，進行行為測試并取材(Fig 1A)。結果顯示，注射皮質酮4周后，模型組小鼠體質量明顯低于正常對照組(P<0.01)，給予越鞠丸對體質量沒有恢復作用(Fig 1B)。皮質酮造模后，小鼠出現快感缺失表型，糖水偏好程度出現明顯下降(P<0.05)，給予越鞠丸能夠修復這一不良表型(P<0.05，Fig 1C)。進一步檢測小鼠的絕望行為，結果也顯示，造模后小鼠的不動時間明顯增加(P<0.01)，越鞠丸能夠明顯降低不動時間(P<0.05，Fig 1D)。在陌生環境攝食測試中，結果顯示，皮質酮造模能夠明顯增加小鼠的首次攝食延遲時間(P<0.01，Fig 1E)，并明顯降低總攝食量(P<0.05，Fig 1F)，越鞠丸能夠逆轉這一現象(P<0.05)。這些結果均提示，越鞠丸給藥能夠修復皮質酮誘導的抑郁樣行為。

Fig 1 Effect of Yueju pill on depressive behavior induced by

A:CORT treatment paradigm and behavior test; B: Weight of mice after 4-week treatment; C: Effect of Yueju pill and CORT on sucrose preference; D: Effect of Yueju pill and CORT on immobility time in TST; E: Effect of Yueju pill and CORT on latency in NSF; F: Effect of Yueju pill and CORT on food intake in NSF.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05vsmodel group.

3.2越鞠丸給藥能夠修復皮質酮模型小鼠海馬DG區Ki67+細胞數的減少海馬神經新生的重要內源性指標是Ki67的陽性細胞數量，檢測海馬新生重要腦區DG區的Ki67細胞數量的結果顯示(Fig 2)，皮質酮誘導的小鼠海馬DG區Ki67陽性細胞數量明顯減少(P<0.05)，給予越鞠丸的小鼠Ki67細胞數量與模型組相比明顯增加(P<0.05)，提示越鞠丸能夠增強海馬神經新生。

3.3越鞠丸給藥對PKA-ERK-CREB信號通路的影響如Fig 3所示，與對照組比較，模型組小鼠海馬中PKA、總CREB和總ERK蛋白表達均明顯下降(P<0.05)；給予越鞠丸后，海馬中PKA、總CREB和總ERK蛋白表達均明顯上升(P<0.05)，而p-CREB和p-ERK表達則無明顯變化。

4 討論

本研究通過對小鼠注射皮質酮來誘導產生抑郁樣行為，并分析越鞠丸給藥對該模型小鼠的作用。結果顯示，越鞠丸能夠修復皮質酮誘導產生的抑郁樣表型；進一步檢測小鼠海馬DG區神經新生重要靶點Ki67陽性細胞數量，發現越鞠丸能夠逆轉皮質酮誘導產生的Ki67陽性細胞數量下降，從而增強海馬神經新生；另外對胞內信號通路分子研究結果顯示，越鞠丸能夠增加PKA和ERK及其下游CREB分子信號的表達水平，提示越鞠丸增強海馬神經新生是通過激活PKA-ERK-CREB信號通路實現的。

Fig 2 Effect of Yueju pill on Ki67 positive cells in DG of hippocampus in CORT-induced mice

越鞠丸常用于郁證的治療，我們前期研究結果支持越鞠丸的抗抑郁作用具有快速性的特點：運用動物模型實驗發現，越鞠丸醇提物單次灌胃1 d后，即可檢測到對獲得性無助抑郁行為的緩解作用[9]，而常規單胺類藥物在此模型上至少需要7 d以上處理時間才能起作用[10]，并且越鞠丸的快速解郁與氯胺酮作用效果相似。然而，臨床上應用越鞠丸大多采用重復給藥方式，進一步我們在小鼠研究中也發現，越鞠丸重復給藥也能夠起到抗抑郁作用[8]。本研究則在廣泛應用的皮質酮誘導小鼠抑郁樣表型的模型上，探索越鞠丸作用的分子機制。皮質酮水平的變化對抑郁行為有重要的影響，Camargo等[11]研究發現，慢性的糖皮質激素水平升高可以導致抑郁樣表型，而慢性皮質酮水平增高可以模擬人類壓力引發的抑郁癥。在此基礎上，本研究在皮質酮誘導抑郁模型小鼠中驗證了越鞠丸給藥的抗抑郁作用，發現通過1周的給藥能夠迅速逆轉皮質酮誘導產生的抑郁樣行為，改善糖水偏好、懸尾測試的不動時間，同時在陌生環境攝食行為中也獲得了相一致的結果。證明越鞠丸能夠在不同類型的小鼠抑郁模型中獲得一致的結果，提示其抗抑郁作用具有廣泛性。

Fig 3 Effect of Yueju pill on PKA-ERK-CREB signaling pathway in CORT-induced

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsmodel group

抗抑郁藥可能通過保護受損海馬神經元，并促進其新生的方式來起到抗抑郁作用。Hodes等[12]發現，氟西汀給藥可以明顯增強小鼠海馬DG區神經細胞的新生。單次給予氯胺酮能夠快速提高海馬神經新生，這也是其快速抗抑郁的可能作用機制之一。因此，神經新生對于抑郁癥發病機制及抑郁癥治療有著十分重要的作用。海馬神經新生的重要內源性指標是Ki67的陽性細胞數量，因而本研究檢測了海馬新生關鍵腦區齒狀回的Ki67陽性細胞數量。結果提示，越鞠丸給藥能夠明顯改善皮質酮誘導的小鼠海馬神經細胞損傷，促進海馬神經元細胞增殖，說明越鞠丸抗抑郁的作用很可能是通過增強神經元增殖來實現的。

研究表明，CREB信號的激活能夠增加海馬DG區神經元的增殖[13]，從而介導行為的改變。此外，海馬神經新生需要多條信號通路參與，包含很多種轉錄因子，而CREB也是其中非常重要的一個轉錄因子[14]。前期研究發現，越鞠丸可以迅速增強海馬的BDNF表達，并持久激活 CREB信號，提示 CREB及其相關的突觸可塑性信號在介導越鞠丸抗抑郁中可能發揮主導作用。PKA-CREB信號通路在抑郁癥的發病機制和抗抑郁機制中起著重要作用，Xue等[7]研究顯示，與抑郁模型小鼠相比，越鞠丸給藥小鼠的海馬中PKA、CREB信號明顯上調，說明越鞠丸特異性地作用于該信號通路。本研究進一步檢測了越鞠丸給藥對皮質酮誘導抑郁小鼠模型中PKA-CREB信號通路蛋白表達的影響。結果顯示，越鞠丸給藥也可上調皮質酮誘導抑郁小鼠海馬中PKA、總CREB、總ERK的表達水平，這與前期在習得性無助模型上，發現越鞠丸給藥能夠激活PKA-CREB信號通路并起到抗抑郁作用的研究結果相一致[8]，說明在不同模型上越鞠丸作用的分子機制是相類似的。本研究中，p-CREB與p-ERK表達沒有變化，提示越鞠丸的抗抑郁作用是通過提高CREB和ERK蛋白表達總量來實現的，這與之前報道，越鞠丸能夠上調KM小鼠海馬組織CREB和ERK磷酸化表達水平的結果不一致[11]。究其原因，可能是由于小鼠品系差異造成的。在本課題組另一項研究中也發現，急性給予越鞠丸的抗抑郁作用僅能夠在C57BL/6N小鼠上維持24 h(投稿中)。也有文獻報道，不同時間應激對p-ERK與p-CREB 的含量調控是雙向的[15]，因此，磷酸化蛋白變化與抗抑郁作用變化并不一定完全一致。本研究的結果也從另一側面說明PKA-ERK-CREB信號通路對于維持抗抑郁藥物的作用非常重要。

本研究在經典的皮質酮誘導抑郁模型中驗證了越鞠丸的抗抑郁作用，并且進一步分析了其內在分子機制。結果提示，越鞠丸給藥可以提高海馬神經新生細胞數量，上調PKA、CREB、ERK表達水平，因而其抗抑郁作用可能是通過激活PKA-ERK-CREB信號通路，進而增強海馬神經新生來實現的。下一步應繼續分析海馬神經新生是如何參與了越鞠丸抗抑郁作用，以及突觸可塑性與神經新生關系的具體分子機制，為其臨床推廣應用提供一定的理論依據。

(致謝：本研究在南京中醫藥大學基礎醫學院中醫腦病重點實驗室暨轉化系統生物學與神經科學研究中心完成，感謝實驗室主任陳剛教授給予的指導和幫助，特此致謝!)