給予鹽酸氨基葡萄糖和硫酸氨基葡萄糖后的氨基葡萄糖藥動學和生物利用度研究

喻 斌，劉卓群，柴 川，崔小兵，阮 鳴

(1. 南京中醫藥大學藥學院，江蘇 南京 210023；2. 南京市棲霞區婦幼保健院醫教科，江蘇 南京 210028；3. 南京曉莊學院食品科學學院，江蘇 南京 211117)

氨基葡萄糖(C6H13NO5，相對分子質量179.17)作為一種天然氨基單糖，被認為是機體合成蛋白聚糖和黏多糖的中間物，后者分布于胃腸黏膜、關節軟骨基質和滑液中。美國FDA已將氨基葡萄糖歸為骨關節炎患者的膳食補充劑[1]。氨基葡萄糖除了能緩解腸炎、骨關節炎外[2-3]，還具有改善空間學習和記憶障礙[4]、刺激免疫、抗腫瘤、保護心臟和神經作用[5]。氨基葡萄糖可從甲殼類動物的殼聚糖和甲殼素外骨骼中提取，經過鹽酸化或硫酸化后，變成穩定的可以口服的鹽酸氨基葡萄糖(glucosamine hydrochloride，GH，相對分子質量215.63)和硫酸氨基葡萄糖(glucosamine sulfate，GS，相對分子質量277.25)[6-7]。雖然它們的總體藥理作用相似，但也有研究發現存在一定的藥效學差異[8]。而它們在藥動學和生物利用度方面是否也存在差異，目前還未見報道。為了更好地指導臨床用藥，本課題以GS和GH中的氨基葡萄糖為研究對象，建立了靈敏度好、準確度高的 LC-MS/MS 定量分析方法，并對其在大鼠體內的藥動學特征、絕對生物利用度和相對生物利用度進行了研究。

1 材料

1.1藥物與試劑GH標準品(批號1206A023)、GS標準品(批號816A022)、茶堿標準品(批號310B021)，均購自北京索萊寶科技有限公司；GH片劑(江蘇正大清江制藥有限公司，批號171009)；GS膠囊(浙江海正藥業股份有限公司，批號71707172)；乙腈、甲酸為色譜級；其他試劑為分析純。

1.2儀器Shimadzu LC-20AD XR型超快速液相色譜儀(UFLC)，日本島津公司，匹配SIL-20A自動進樣器、DGU-20A3在線脫氣機、CTO-20AC柱溫箱；AB SCIEX QTRAP 5500型三重四級桿線性離子阱質譜儀，美國AB SCIEX公司；Analyst 1.5質譜工作站軟件，美國AB SCIEX公司；Milli-Q純水機，美國Millipore公司；Allegra 64R型臺式高速冷凍離心機，美國貝克曼公司。

1.3實驗動物清潔級SD大鼠，♂，體質量(200±20)g，購自上海杰思捷實驗動物有限公司，動物合格證號：SCXK(滬)2013-0006。

2 方法

2.1溶液的配制

2.1.1標準工作液的配制 稱取15.47 mg GS對照品(含氨基葡萄糖10 mg)，置10 mL量瓶中，加純水溶解，并稀釋至刻度，配制成1 g·L-1的氨基葡萄糖儲備液。

2.1.2內標溶液的配制 精密稱取茶堿0.12 mg，用含質量分數0.1%甲酸的乙腈溶液配制成質量濃度為12 mg·L-1的儲備液。再精密吸取上述儲備液1 mL至50 mL量瓶，配制成質量濃度為0.24 mg·L-1的內標溶液。

2.2動物分組、給藥方法和樣本采集SD大鼠24只，隨機分為4組，每組6只：GH灌胃組、GH注射組、GS灌胃組、GS注射組。灌胃組劑量均為125 mg·kg-1，故氨基葡萄糖實際給藥量GH組為103.86 mg·kg-1，GS組為80.78 mg·kg-1。注射組采用尾靜脈注射，GH和GS的劑量均為20 mg·kg-1，故氨基葡萄糖實際給藥量GH組為16.62 mg·kg-1，GS組為12.92 mg·kg-1。灌胃組大鼠給予GH或GS后，于5、15、30、45、60、120、240、360、480、600 min眼眶取血0.5 mL于肝素化離心管中。靜脈注射組取血時間點為給藥后0、2、5、8、15、30、45、60、120、240、480 min，全血2 500 r·min-1離心10 min，取血漿用于后續處理。

2.3樣本預處理取血漿150 μL，加入100 μL內標溶液，內標終濃度為96 μg·L-1。混勻，靜置10 min，16 000 r·min-1離心10 min，收集上清液進樣。

2.4LC-MS/MS條件色譜條件：色譜柱Hedera ODS-3(4.6 mm×250 mm，5 μm)，乙腈 ∶0.1%甲酸=70 ∶30，流速0.3 mL·min-1，柱溫30 ℃，進樣體積3 μL。

質譜條件：采用電噴霧離子源正離子掃描模式(ESI+)；多反應監測掃描模式(MRM)；碰撞氣壓力(CAD)：Medium；氣簾氣壓力(CUR)：35 PSI；電噴霧電壓(IS)：4 500 V；離子源溫度(TEM)：550 ℃；霧化器壓力(GS1)：50 PSI； 輔助氣壓力(GS2)：50 PSI。 氨基葡萄糖：m/z 180.10→162.20；碰撞能量(CE)：9 eV；去簇電壓(DP)：41 eV。茶堿(內標)：m/z 181.07→124.06；CE：25 eV； DP：26 eV。

2.5數據分析所有時間點血藥濃度測定值以均值表示，繪制血藥濃度-時間曲線。用DAS 3.0軟件進行數據處理，以非房室模型求出藥代動力學參數。絕對生物利用度(F絕對)和相對生物利用度(F相對)計算公式如下[9-10]。

F絕對=(AUCig×Div)/(AUCiv×Dig)×100%，其中D為給予氨基葡萄糖的劑量，ig和iv分別為灌胃和注射給藥。故本實驗中FGH-absolute=(AUCig×16.62)/(AUCiv×103.86)×100%，FGS- absolute=(AUCig×12.92)/(AUCiv×80.78)×100%。

以GS為參比對照，根據Frelative=(AUCGH×DGS)/(AUCGS×DGH)×100%公式，本實驗Fiv-relative=(AUCGH-iv×12.92)/(AUCGS-iv×16.62)×100%，Fig-relative=(AUCGH-ig×80.78)/(AUCGS-ig×103.86)×100%。

3 結果

3.1方法學考查

3.1.1專屬性實驗 取大鼠空白血漿、含有對照品的血漿及給藥后血漿3種血漿樣品，按“2.3”項下預處理，觀察內源性成分對氨基葡萄糖和內標的影響。如Fig 1所示，氨基葡萄糖和內標的保留時間分別為1.69 min和2.43 min。血漿中的內源性物質不干擾這兩種化合物的測定，表明該方法專屬性良好。

Fig 1 Representative extraction chromatograms of glucosamine in mode of MRM in rat plasma

A: Blank plasma sample; B: Blank plasma sample spiked with GH (3.125 mg·L-1) and IS (96 μg·L-1); C: Plasma sample. Glucosamine: m/z 180.10→162.20; IS: m/z 181.07→124.06.

3.1.2標準曲線的繪制 取大鼠空白血漿，加入氨基葡萄糖儲備液和內標溶液，使血漿中氨基葡萄糖終濃度為50、25、12.5、3.125、1.56、0.78、0.078、0.007 8 mg·L-1，混勻，靜置10 min，16 000 r·min-1離心10 min，收集上清液進樣。以血漿中氨基葡萄糖的提取離子流圖(XIC)峰面積和內標的峰面積之比為橫坐標(x)，以氨基葡萄糖濃度為縱坐標(y)繪制標準曲線，確定線性范圍。另外取血漿標準品溶液逐級稀釋，以信噪比S/N=3和S/N=10時的濃度，分別作為最低檢測限和最低定量限。氨基葡萄糖的回歸方程為Y=0.620X+0.008，r=0.999。線性范圍為0.007 8～50 mg·L-1，最低定量限為0.007 8 mg·L-1，最低檢測限為0.000 78 mg·L-1。

3.1.3提取回收率和基質效應 取空白大鼠血漿，加入氨基葡萄糖儲備液和內標溶液，配制成氨基葡萄糖終濃度為12.5、1.56、0.078 mg·L-1的質量控制(QC)樣本，每個濃度平行制備5份樣本，按“2.3”項下方法處理后進樣分析，得目標分析物峰面積為A。另取空白血漿，除不加標準品和內標外，其余同“2.3”項下進行除蛋白和高速離心預處理，向上清液中加入GS和內標，使氨基葡萄糖濃度為12.5、1.56、0.078 mg·L-1，進樣分析，得目標分析物峰面積為B。最后，利用流動相制備終濃度為以上3種濃度的氨基葡萄糖及內標的混合溶液，進樣分析，得目標分析物峰面積為C。計算提取回收率=A/B×100%，考察基質效應=B/C×100%。結果顯示，氨基葡萄糖提取回收率為89.1%～91.4%，基質回收率為99.3%～100.3%。內標提取回收率為89.5%，基質回收率為89.6%。

3.1.4精密度和準確度 參照標準曲線與定量范圍，利用空白血漿配制3種不同濃度的QC樣本。按“2.3”項下進行樣品處理，在1 d內不同時間進樣，計算日內精密度(RSD)和準確度(RE)。另外，在5日內進樣，計算日間RSD和RE，結果見Tab 1。

Tab 1 Intra-day and inter-day precision/ accuracy tests of glucosamine(n=5)

3.1.5穩定性考察 對3種不同濃度的QC溶液在室溫(20 ℃)24 h、-20 ℃冰凍30 d，以及反復凍融3次后，觀察回收率。結果見Tab 2。

Tab 2 Stability tests of glucosamine(n=5)

3.2藥動學特征及生物利用度評價大鼠經口服和注射給藥后，GH和GS中氨基葡萄糖的平均血藥濃度-時間曲線見Fig 2。采用DAS 3.0軟件，以非房室模型統計分析其藥代動力學參數，結果見Tab 3。

4 討論

在優化質譜參數的過程中，氨基葡萄糖起初選用和文獻報道一樣的離子碎片(m/z 180.10→72)[11]，但結果發現子離子響應較差(檢測限約為5 μg·L-1)，而子離子采用162.20后，靈敏度明顯提高，檢測限達到目前的0.78 μg·L-1，且穩定性很好。本次實驗采用的UFLC-MS/MS方法，質譜電噴霧電離源(ESI+)將樣品離子化，多反應離子監測(MRM)準分子離子峰，具有選擇性好、靈敏度高、分析時間短等優點，能夠迅速、靈敏地檢測氨基葡萄糖的血藥濃度。

Tab 3 Pharmacokinetical parameters of glucosamine after ig/iv administration of n=6)

Fig 2 Mean plasma concentration-time curves of glucosamine after administration of GH or GS in n=6)

A: Group of injective GH (20 mg·kg-1); B: Group of oral GH (125 mg·kg-1); C: Group of injective GS (20 mg·kg-1); D: Group of oral GS (125 mg·kg-1).