煙霧所致輕度穩定期COPD小鼠肺組織中MRP1表達增加與Nrf2信號通路有關

吳 潔，姚兆敏，方 偉，吳青青，曹 鵬，汪電雷,2

(安徽中醫藥大學1. 研究生院、2. 藥物代謝動力學研究室，安徽 合肥 230031；3. 江蘇省中醫藥研究院細胞與分子生物學實驗室，江蘇 南京 210028)

多藥耐藥相關蛋白1 (multidrug resistance-associated protein 1, MRP1)是一種依賴于ATP介導的底物跨膜轉運蛋白，在肺部炎癥反應、氧化應激、毒性物質解毒等方面發揮著積極的作用，并在慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)發病過程中起著保護作用[1-2]。NF-E2相關因子2 (NF-E2-related factor 2, Nrf2)是一種氧化還原敏感的堿性亮氨酸拉鏈蛋白轉錄因子，參與多種解毒和抗氧化基因的調控[3]。以往大量研究表明，MRP1、Nrf2在COPD患者肺組織中的表達明顯降低[4-5]。然而，近期研究發現，輕度穩定期COPD患者仍可以通過激活Nrf2/ARE來抵御細胞內活性氧(reactive oxygen species, ROS)[6]，但MRP1蛋白的表達是否也呈現這種趨勢尚未可知。本實驗通過對野生型(wide type, WT)及Nrf2敲除型(-/-) C57BL/JNju小鼠建立輕度穩定期COPD模型，研究輕度穩定期COPD疾病狀態下，Nrf2信號通路的作用特點及其對MRP1蛋白表達的影響，探討Nrf2/MRP1系統對肺組織的保護作用，驗證機體通過上調Nrf2及其靶基因的能力是否也可能是決定COPD嚴重程度和進展的關鍵指標，旨在為COPD的預防及早期治療提供理論參考。

1 材料與方法

1.1實驗動物SPF級C57BL/JNju野生型♂小鼠和Nrf2基因敲除型♂小鼠，體質量16～22 g。C57BL/JNju野生型小鼠購自南京大學南京生物醫藥研究院，合格證號：SCXK (蘇) 201701627。于安徽中醫藥大學實驗動物中心內飼養1周，溫度(25±2)℃、相對濕度(55±10)%。Nrf2基因敲除小鼠由江蘇省中醫藥研究院提供(Johns Hopkins University引進)，在安徽中醫藥大學動物中心繁殖擴群。本實驗中所涉及到的實驗動物均符合倫理委員會的相關規定。

1.2試劑黃山牌香煙購自安徽中煙工業有限責任公司(香煙焦油量：1 mg，煙氣煙堿量：1.1 mg)；DAB顯色試劑、GAPDH抗體，購自北京中杉金橋生物技術有限公司；BCA蛋白定量試劑盒購自碧云天生物技術研究所；Nrf2抗體、血紅素加氧酶-1(heme oxygenase-1, HO-1)抗體，購自美國Santa Cruz公司；MRP1抗體購自英國Abcam公司；ECL超敏發光試劑盒購自美國Pierce公司。

1.3方法

1.3.1輕度穩定期COPD小鼠模型的建立 據文獻考察，煙熏4周～6個月均可誘導小鼠成為COPD模型[7]，但病程如：肺功能、肺泡細胞損傷及凋亡、炎癥細胞數量等會隨著煙熏時間的增長而改變[8]。煙熏4周[9]，通常可以達到符合疾病明顯病變特點的程度，但研究藥物干預作用的COPD模型則需經過更長時間的暴露刺激。本實驗目的是探究疾病初期的病理機制特點，所以采用煙熏4周建立輕度穩定期COPD小鼠模型。♂C57BL/JNju WT小鼠20只，♂Nrf2-/-小鼠20只，按照隨機分組的原則分為：A(WT正常組)、B(WT模型組)、C(Nrf2-/-正常組)、D(Nrf2-/-模型組)共4組，每組10只。將B、D組小鼠放入自制的煙熏缸中(體積100 cm×100 cm×100 cm，側壁有2 cm直徑的通氣孔，以此來保持缸內氣壓的穩定)，讓小鼠被動吸煙，1次15支香煙，每次持續約1 h，每天煙熏4次，每次間隔大于30 min，連續4周。

1.3.2小鼠呼吸功能的測定 將小鼠以3.5%的水合氯醛(10 mL·kg-1)腹腔注射注射麻醉后，用手術刀切開氣管插管，將其仰臥于動物呼吸機的密閉體描箱內，測定其肺功能。主要的檢測指標包括FEV0.1、FEV0.3/FVC%、PEF、FEF25-75、順應性(Cdyn)。

1.3.3標本收集 小鼠肺功能測定后，迅速取出左肺組織，固定于4%多聚甲醛中，用于肺部組織病理學變化、免疫組化檢測。其右肺組織立即放入液氮罐中保存，后放入-80 ℃凍存，用于Western blot檢測。

1.3.4肺組織病理學檢查 取小鼠的左肺組織用4%多聚甲醛固定，進行脫水、透明、浸蠟、包埋，切片(厚5 μm)。采用HE染色、中性樹膠封片，光鏡下觀察染色結果。

1.3.5免疫組化檢測 取小鼠左肺組織石蠟切片(5 μm)，分別滴加Nrf2及MRP1一抗，4 ℃孵育過夜，滴加二抗生物素化山羊抗兔液，DAB顯色，蘇木精復染細胞核。用乙醇逐步脫水，中性樹膠封片，顯微鏡觀察。

1.3.6Western blot檢測 將右肺組織剪碎，加入裂解液，勻漿后，離心10 min，分離上清液，在562 nm波長下，檢測蛋白濃度。配制SDS-PAGE膠，每個膠孔上10 μL的蛋白，電泳后，切下目標蛋白范圍內的凝膠，然后將蛋白轉移到NC膜上，用5%脫脂奶封閉2 h后，PBS-T緩沖液洗脫3次，每次3 min。隨后加入稀釋到相應倍數的一抗，4 ℃孵育，孵育完成，PBS-T洗脫3次，每次3 min。加入二抗孵育2 h后，PBS-T洗脫3次，每次5～8 min，用ECL顯色后，凝膠成像儀曝光顯影。

2 結果

2.1造模后Nrf2、HO-1、MRP1在WT小鼠肺組織中的表達明顯上升Fig 1為煙熏前后WT小鼠的肺組織中Nrf2、HO-1、MRP1蛋白條帶圖，選擇GAPDH蛋白作為實驗內參。利用Quantity One軟件對電泳條帶進行灰度值分析，結果表明，與WT正常組相比，煙熏4周后，MRP1、Nrf2在WT模型組中的表達明顯增多(P<0.01)，說明模型組小鼠仍然具有上調Nrf2與MRP1表達來抵御氧化應激以及外源性異物損傷的能力，并且兩個蛋白的表達趨勢一致。為了進一步探究Nrf2的蛋白表達情況及Nrf2的轉錄活性，實驗同時檢測了Nrf2轉錄激活產物HO-1的表達情況。結果顯示，WT模型組中HO-1的表達較WT正常組明顯上升(P<0.01)，說明Nrf2在蛋白水平上被激活，轉錄活性增強。

Fig 1 Expression of Nrf2, HO-1 and MRP1 protein in lung tissues of WT different

**P<0.01vsWT normal group

2.2各肺功能指標檢測均符合慢性支氣管炎和阻塞性肺氣腫的病理學特征肺功能是評價COPD模型建立的重要評價標準之一，FEV0.1、FEV0.3/FVC%是檢測氣流受限的敏感指標，PEF、FEF25-75、Cydn對小氣道氣流受限敏感性較高，可較好地反映小氣道功能。Tab 1結果顯示，WT模型組小鼠和Nrf2-/-模型組小鼠分別與WT正常組和Nrf2-/-正常組相比，FEV0.3/FVC%、FEV0.1、PEF、FEF25-75、Cydn均明顯降低(P<0.01或P<0.05)，符合慢性支氣管炎和阻塞性肺氣腫的病理學特征，并且與WT模型組相比，以上各指標在Nrf2-/-模型組中的改變趨勢更為明顯(P<0.05)。

2.3HE染色結果符合COPD的特征性病理改變如Fig 2所示，WT正常組及Nrf2-/-正常組小鼠肺泡大小均勻，結構清晰，氣道黏膜上皮結構完整，纖毛排列整齊。WT模型組及Nrf2-/-模型組小鼠肺泡腔不規則擴大，部分形成肺大泡，肺間質內可見不同程度的炎細胞浸潤，并且在Nrf2-/-模型組小鼠中更為明顯。同時，Nrf2-/-模型小鼠肺泡毛細血管廣泛受損，肺泡內可見大量紅細胞，這些病理改變造成氣道狹窄，引起固定性氣道阻塞，符合COPD的特征性病理改變。

2.4Nrf2基因敲除抑制了香煙煙霧誘導小鼠肺組織中MRP1蛋白表達的上調Fig 3免疫組化結果顯示，Nrf2、MRP1的蛋白表達主要位于肺支氣管上皮細胞及肺泡間隙中。通過軟件計算積分光密度值后，與WT正常小鼠相比，WT模型組小鼠肺組織中Nrf2、MRP1的表達明顯增多(P<0.05)，呈強陽性表達。而Nrf2-/-正常組及模型組中MRP1的表達均明顯降低，但兩組之間的變化不具有統計學意義(P>0.05)。提示香煙煙霧刺激可以提高小鼠肺中MRP1的蛋白水平，而在Nrf2敲除小鼠體內這一作用則被抑制。

2.5香煙煙霧所致輕度穩定期COPD小鼠肺組織中MRP1表達增加可能與Nrf2信號通路有關如Fig 4所示，與WT正常組相比，MRP1在Nrf2-/-正常組中的表達明顯降低(P<0.01)，說明MRP1蛋白在小鼠肺組織的表達主要依賴于Nrf2；同時，香煙煙熏后與Nrf2-/-正常組相比，MRP1在Nrf2-/-模型組中的表達并未發生明顯改變(P>0.05)。結合“2.1”的實驗結果，進一步說明在輕度穩定期COPD狀態下，Nrf2信號通路被激活，MRP1蛋白的表達上調，并且MRP1的上調可能與Nrf2信號通路的激活有關。

3 討論

COPD是一種能夠治療和預防的常見肺部疾病，以持續的氣流受限為特征，其氣流受限的特征多呈進展性。參照GOLD分級，COPD可分為輕度、中度、重度和極重度4個等級，不同程度的COPD具有

Tab 1 Comparison of pulmonary function measurement results between different

#P<0.05vsWT normal;*P<0.05,**P<0.01vsNrf2-/-normal;△P<0.05vsWT model

Fig 2 Changes in lung histopathology observed after HE staining

Arrows indicate changes in alveolar morphology, inflammatory infiltration, bleeding, and cilia arrangement.

Fig 3 Immunohistochemistry results of Nrf2 and

*P<0.05vsnormal group of WT Nrf2 and WT MRP1. Compared with Nrf2-/-MRP1 normal group, there was no significant change in Nrf2-/-MRP1 model group.

Fig 4 Expression of MRP1 protein

**P<0.01vsWT normal group. Compared with Nrf2-/-normal group, there was no significant change in Nrf2-/-model group.

不同的病理特征及發病機制。在過去的幾十年里，這一問題的研究主要集中在重度COPD上，然而，有關于氣道阻塞不太嚴重的輕度COPD的研究數據極其缺乏。本實驗通過被動煙吸法建立輕度穩定期COPD小鼠模型，探討Nrf2信號通路對輕度COPD小鼠肺支氣管上皮細胞中MRP1表達的影響，期望為COPD的預防及早期治療提供理論參考。

Nrf2作為核轉錄激活因子，是機體細胞氧化應激反應的重要調節器，在氧化應激反應中處于核心位置，并在COPD的發生、發展過程中發揮著重要的作用[10]。以往大量研究顯示，吸煙者的巨噬細胞、COPD患者的整個肺組織中Nrf2表達均下降，并且嚴重肺氣腫患者肺巨噬細胞中HO-1的表達也降低[5]。然而，近期研究結果表明，輕度穩定期COPD患者仍然可以通過上調Nrf2/ARE的表達，來抵御細胞內ROS，但在重度COPD患者中，這條通路則被抑制[6]。田戈等[11]研究也發現，香煙煙霧刺激誘導的COPD模型小鼠，ROS的增加會刺激機體產生氧化應激反應，從而激活Nrf2核轉錄，上調GSH合成限速酶γ-GCS的表達，使GSH的合成增加，參加局部抗氧化作用。由此可以推測，在COPD不同病程時期，患者體內參與病理生理特征的分子機制具有明顯差異，機體通過上調Nrf2及其靶基因的能力可能是決定COPD嚴重程度和進展的關鍵指標之一。因此，深入了解疾病的進程對預防COPD的發生以及抑制COPD的發展具有重要意義。本實驗通過4周香煙煙霧煙熏刺激，建立輕度穩定期COPD小鼠模型[9]，對肺功能及HE染色結果分析發現，Nrf2的缺失加重了香煙煙霧刺激所致的COPD；免疫組化及Western blot結果顯示，與WT正常組相比，Nrf2及其靶基因 HO-1在WT模型組中的表達明顯上升，這一結果與上述文獻的描述相吻合。

MRP1位于多種極性細胞膜表面，是一種依賴ATP介導其底物自細胞內轉運至細胞外的一種膜糖蛋白，屬于ABC超家族中的重要一員[12]。MRP1作為兩性有機陰離子轉運載體，主要介導化學異物、外源性有毒物質等的外排，以及氧化型谷胱甘肽(GSSG)、內源性物質炎癥介質白三烯C4等的跨膜轉運。因此，MRP1在肺部氧化應激反應、炎癥反應、毒性物質解毒方面，以及保護機體免受化學致癌物質侵襲等方面，發揮著重要作用[1]。近年來研究發現，Nrf2信號通路不僅參與調控Ⅱ相解毒酶的表達，同時也參與了轉運體MRPs的表達調控。有證據表明，Nrf2參與了MRP1在人類骨髓性白血病細胞中的表達，當抑制Nrf2-ARE通路時，MRP1的表達下降[13]。與WT小鼠相比，當使用Nrf2的激活劑作用于Nrf2缺失型小鼠后，可以誘導其肝臟組織中MRP2、MRP3、MRP4的表達[14]。同時，在線粒體基因組缺失的肝細胞中，由于其產生ROS的能力下降，Nrf2的核轉位會受到影響，從而可以部分下調對乙酰氨基酚和膽汁酸對肝細胞中MRP1和MRP4的誘導作用[15]。由此我們推測，輕度穩定期COPD小鼠肺組織中MRP1的表達可能也受到Nrf2信號通路的調控。通過免疫組化實驗可知，與WT正常小鼠相比，WT COPD小鼠肺組織中MRP1的表達明顯增多，呈強陽性表達。而Nrf2-/-正常組及模型組MRP1的表達均明顯降低，提示香煙煙霧刺激可以提高小鼠肺中MRP1的蛋白水平，而在Nrf2敲除小鼠體內，這一機制則被抑制。同樣，Western blot結果顯示，與WT正常組相比，MRP1在WT模型組中的表達明顯增多，并且與Nrf2蛋白的表達趨勢具有一致性。為了進一步探究Nrf2的蛋白表達情況及Nrf2的轉錄活性，本實驗檢測了Nrf2轉錄激活產物HO-1蛋白的表達情況。結果顯示，WT 模型組中HO-1的表達較WT正常組明顯上升，說明Nrf2在蛋白水平上被激活，轉錄活性增強。同時，MRP1在Nrf2-/-正常組中的表達較WT正常組明顯降低；香煙煙熏后，與Nrf2-/-正常組相比，MRP1在Nrf2-/-模型組中的表達并未發生明顯改變，進一步說明MRP1在小鼠肺組織中的表達可能是受Nrf2信號通路的調控。

綜上所述，煙霧所致輕度穩定期COPD小鼠肺組織中MRP1表達的增加與Nrf2信號通路有關，因此，機體通過上調Nrf2及其靶基因的能力，也有可能是決定COPD嚴重程度和進展的關鍵指標。目前，還沒有能夠明顯逆轉COPD進展的治療方法，未來可以通過關注疾病進程，抑制COPD患者中Nrf2及MRP1的下降，從而減輕由氧化應激、炎癥反應等因素給疾病進展帶來的負面影響。