舒林酸衍生物K-80003與MEK抑制劑考比替尼聯(lián)合用藥對乳腺癌的效果研究

李宗熹，種姝伊，古麗米然·阿里同別克，連寶環(huán)，蔣福全，張曉坤

(廈門大學(xué)藥學(xué)院，福建 廈門 361102)

癌癥已經(jīng)成為威脅人類健康的頭號殺手。近年來，隨著社會經(jīng)濟(jì)的不斷發(fā)展，癌癥的發(fā)病率和死亡率在我國呈不斷上升趨勢[1]。其中，乳腺癌已成為威脅女性健康的最大隱患，在我國，平均每45位女性中就有1位罹患乳腺癌[2-3]。因此，如何治療乳腺癌仍然是醫(yī)藥工作者們的重點(diǎn)攻克對象。常規(guī)的藥物治療效果有限，而放射療法或者外科手術(shù)對患者身體的傷害更甚。因此，在現(xiàn)有基礎(chǔ)上，通過藥物的不同作用機(jī)制，嘗試藥物的不同組合方法，從不同途徑上遏制乳腺癌的發(fā)生發(fā)展，對于乳腺癌的治療有著積極的推動意義。

通過大量的實(shí)驗，本課題組發(fā)現(xiàn)一種化合物舒林酸。實(shí)驗證明，舒林酸通過抑制類維甲酸受體的截斷形式(以下簡稱tRXRα)與p85α之間的相互作用，能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，發(fā)揮抗癌作用。然而，因其抑制環(huán)氧化酶1 (cyclooxygenase-1, COX-1) 和環(huán)氧化酶2 (cyclooxygenase-2, COX-2)的活性，舒林酸會引起如胃腸道出血及心臟毒性等副作用，這些缺點(diǎn)制約了該藥物發(fā)展成為臨床上真正的抗腫瘤藥物。本課題組通過計算機(jī)輔助設(shè)計，以化學(xué)方法合成了一系列舒林酸衍生物，發(fā)現(xiàn)其中一個衍生物K-80003具有更強(qiáng)的tRXRα親合性，對包括乳腺癌在內(nèi)的多種腫瘤具有更好的抗癌效果，且不具有抑制COX-2活性的作用[4-5]。目前，K-80003是全球首個以tRXRα為靶點(diǎn)的原創(chuàng)候選新藥，具有非常廣闊的前景。

胞外信號調(diào)控激酶(extracellular signal-regulated kinase, ERK)是一類絲/蘇氨酸蛋白激酶，處于RAS/RAF/MEK/ERK信號通路的最下游，正常定位于胞質(zhì)，激活后轉(zhuǎn)位至胞核，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子活性，產(chǎn)生細(xì)胞效應(yīng)。ERK在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移過程中起中介和放大信號的作用，一般情況下，在腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)[6]。但是在我們前期研究中發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌細(xì)胞中，K-80003可以意外地激活p-ERK，所以我們設(shè)想，將K-80003與一種MEK抑制劑GDC-0973聯(lián)合用藥的話，一方面抑制了PI3K/Akt信號通路[4]，另一方面可以抑制由K-80003引起的ERK信號通路的激活，理論上可以對乳腺癌形成雙重阻斷，使抗腫瘤效果更為明顯。

1 材料

1.1細(xì)胞株人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7 (ATCC)。

1.2實(shí)驗動物自發(fā)乳腺癌MMTV-PyMT轉(zhuǎn)基因小鼠，SPF級，♀，8周齡，自主繁殖于廈門大學(xué)實(shí)驗動物中心。

1.3藥物與試劑K-80003(康龍化成新藥技術(shù)有限公司合成，純度>98%)；GDC-0973(MCE公司，貨號HY-13064)。β-actin抗體(Sigma公司，A5441)；p-ERK抗體(CST公司，4370S)；PARP(Santa Cruz公司，sc-7156)；免疫組化兔二抗(PV-9001)、DAB顯色液(ZLI-9018)，均購于中杉金橋公司；DMEM(Hyclone公司)；胎牛血清(GEMINI公司)。

1.4儀器Model 3550酶標(biāo)儀、CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo公司)；Eps 200電泳儀(Tanon公司)；光學(xué)顯微鏡(Beckman公司)；組織包埋機(jī)、石蠟切片機(jī)(Leica公司)。

2 方法

2.1細(xì)胞實(shí)驗將MCF-7細(xì)胞以每孔3×105個細(xì)胞的密度接種于12孔板，細(xì)胞貼壁后，分為正常對照組、K-80003單藥組(40 μmol·L-1)、GDC-0973單藥組(5 μmol·L-1)、聯(lián)合用藥組(K-80003 40 μmol·L-1+GDC-0973 5 μmol·L-1)，并另設(shè)一組加入TNF-α(20 μg·L-1)模擬腫瘤細(xì)胞微環(huán)境。收樣后提取相關(guān)蛋白，Western blot法檢測各組中相關(guān)蛋白的表達(dá)差異，實(shí)驗獨(dú)立重復(fù)3次。

2.2實(shí)驗動物分組與給藥挑選腫瘤均勻的8周齡左右MMTV-PyMT小鼠，按照體質(zhì)量隨機(jī)分為4組：正常對照組、K-80003單藥組(30 mg·kg-1)、GDC-0973單藥組(5 mg·kg-1)、聯(lián)合用藥組(K-80003 30 mg·kg-1+GDC-0973 5 mg·kg-1)，每組7只。分別于每日15 ∶00灌胃給予不同藥物。連續(xù)給藥15 d，末次給藥后3 h眼部取血，斷脊處死后，常規(guī)解剖收樣，進(jìn)行后續(xù)分析。解剖時，對各組小鼠的體質(zhì)量、腫瘤質(zhì)量進(jìn)行稱重記錄，同時計算腫瘤質(zhì)量抑制率：腫瘤質(zhì)量抑制率=(對照組腫瘤質(zhì)量-實(shí)驗組腫瘤質(zhì)量)/對照組腫瘤質(zhì)量×100%。

2.3腫瘤組織切片染色實(shí)驗取新鮮的腫瘤樣品，放入4%多聚甲醛中固定過夜后，石蠟包埋。將組織蠟塊在組織切片機(jī)上做連續(xù)4 μm切片，脫蠟后，HE染色進(jìn)行形態(tài)學(xué)評價。另取一張相同組織的石蠟切片，脫蠟后，對相應(yīng)蛋白進(jìn)行免疫組化染色，通過光學(xué)顯微鏡觀察染色結(jié)果，棕黃色為陽性信號。

3 結(jié)果

3.1聯(lián)合用藥能更好地促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡如Fig 1所示，當(dāng)給藥時間為6 h時，聯(lián)合用藥組PARP出現(xiàn)明顯切割帶，且在TNF-α模擬腫瘤微環(huán)境的刺激下，此現(xiàn)象更加明顯，說明聯(lián)合用藥組在MCF-7細(xì)胞中促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用優(yōu)于K-80003單藥組。

A: Western blot analysis of PARP in MCF-7 cell line, 0% FBS 6 h. K-80003: 40 μmol·L-1; GDC-0973: 5 μmol·L-1; TNF-α: 20 μg·L-1； B: Western blot analysis of PARP in tumor tissue.

同樣的，提取小鼠腫瘤組織蛋白，Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合用藥組的PARP切割更為明顯，說明聯(lián)合用藥組在抑制小鼠腫瘤方面效果更好。

3.2聯(lián)合用藥能更好地抑制小鼠腫瘤生長對小鼠體質(zhì)量、腫瘤質(zhì)量、腫瘤抑制率分析發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合用藥組與K-80003單藥組相比，抑制小鼠腫瘤生長作用更為明顯(Fig 2)。小鼠腫瘤組織的石蠟切片染色結(jié)果顯示，聯(lián)合用藥組腫瘤質(zhì)地比較松散，提示腫瘤發(fā)展并未達(dá)到十分嚴(yán)重的階段。同時，標(biāo)志著腫瘤細(xì)胞生長的蛋白Ki-67表達(dá)也大幅度降低，說明聯(lián)合用藥組能夠更好地抑制腫瘤生長。

3.3聯(lián)合用藥通過抑制p-ERK的激活從而起到協(xié)同作用如Fig 3所示，在MCF-7細(xì)胞和小鼠腫瘤組織中均可以檢測到，由K-80003激活的p-ERK在聯(lián)合用藥組中完全被抑制。免疫組化染色結(jié)果進(jìn)一步顯示，K-80003激活的p-ERK在聯(lián)合用藥組中基本不表達(dá)。以上結(jié)果提示，聯(lián)合用藥通過抑制p-ERK的表達(dá)，從而提高K-80003治療乳腺癌的敏感性，加強(qiáng)了治療效果。

4 討論

乳腺癌的治療，仍然是擺在當(dāng)今世界醫(yī)學(xué)界的一道難題。常規(guī)的化療手段對患者的精神和經(jīng)濟(jì)都造成了嚴(yán)重的負(fù)面影響，且預(yù)后較差，不能從根本上抑制乳腺癌的產(chǎn)生和發(fā)展[7-8]。因此，開發(fā)更多的藥物靶點(diǎn)，從源頭上抑制乳腺癌的產(chǎn)生和發(fā)展成為科研工作者的研究熱點(diǎn)。找到特異性靶向腫瘤發(fā)生發(fā)展中關(guān)鍵基因的配體[9-10]，開發(fā)新藥，可以有效減少患者由傳統(tǒng)療法帶來的痛苦感，將腫瘤的發(fā)生和發(fā)展遏制在搖籃階段。本課題組前期在對K-80003抗乳腺癌的研究中，意外發(fā)現(xiàn)給小鼠灌胃K-80003時，小鼠腫瘤細(xì)胞受到抑制的同時，腫瘤細(xì)胞內(nèi)的p-ERK出現(xiàn)了異常激活現(xiàn)象，這與我們對ERK信號通路的常規(guī)認(rèn)知相悖，由此我們對這個現(xiàn)象展開了積極討論。那么基于以上的猜想，小鼠灌胃K-80003的同時，使用一種業(yè)界公認(rèn)的ERK信號通路抑制劑，從兩條途徑上阻斷乳腺癌的產(chǎn)生和發(fā)展，是否會達(dá)到更好的效果？本實(shí)驗結(jié)果表明，高濃度、短時間K-80003刺激下，ERK作為一條應(yīng)激生存通路會在細(xì)胞中反常激活，而聯(lián)合用藥時，GDC-0973可以抑制由K-80003引起的ERK激活，從而達(dá)到更好的治療效果，在細(xì)胞上和動物上都有著較為穩(wěn)定的結(jié)論。本實(shí)驗還有一些比較有意思的現(xiàn)象值得討論：已知K-80003是視黃醇X受體(retinoid X receptor, RXR)的配體，有研究表明，K-80003能夠修飾RXR，修飾后的RXR可廣泛作用于體內(nèi)各種信號通路，如PI3K/Akt信號通路等[4]。細(xì)胞內(nèi)信號通路往往聯(lián)系緊密復(fù)雜，那么，在K-80003的刺激下，RXR能否與這些信號通路相互作用，從而對ERK信號通路產(chǎn)生影響？而且，大部分信號通路的激活是一個短暫的、瞬時的過程，在經(jīng)過一定時間后，細(xì)胞內(nèi)的信號通路變化可能與短時間的結(jié)果有所不同。K-80003長時間，甚至是低濃度的穩(wěn)定刺激下，ERK信號通路還會有怎樣的變化？對于這些問題的深入研究，可以幫助我們進(jìn)一步揭示乳腺癌的發(fā)病機(jī)制，從而更好地對抗乳腺癌。

A: Tumor weight; B: Tumor growth inhibition rate; C: HE staining and IHC analysis Ki-67 in tumor tissue.*P<0.05,**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsK-80003.

Fig 3 Effect of K-80003 in combination with GDC-0973 on p-ERK

A: Western blot analysis of p-ERK in MCF-7 cells line. 0% FBS 1 h. K-80003: 40 μmol·L-1; GDC-0973: 5 μmol·L-1; TNF-α: 20 μg·L-1; B: Western blot analysis of p-ERK in tumor tissue; C: IHC analysis of p-ERK in tumor tissue.