槲皮素Pluronic P123/Poloxamer 188混合膠束體外釋放和藥代動力學研究

宗 蕊，王 翠，郭童林，沈麗霞

(河北北方學院藥學系，河北省神經藥理學省重點實驗室，河北 張家口 075000)

槲皮素(quercetin，3，3’，4’,5，7-五羥基黃酮)是一種植物多元酚，所含的生物黃酮素廣泛存在于各種蔬菜與水果中[1]。研究表明，槲皮素毒性低，具有抗病毒、抗氧化、抗炎、抗腫瘤、心血管系統和神經系統保護等多種藥理作用[2-3]。但槲皮素水溶性差，在水中溶解度僅為0.166～7.7 mg·L-1[4]，化學結構不穩定(尤其是在堿性溶液中極易分解)，且大部分藥物在到達體循環之前已基本代謝[5]，限制了其臨床應用。因此，提高槲皮素水溶性和增強化學穩定性，延長藥物半衰期成為選擇合適劑型的關鍵。聚合物膠束作為一種新型的納米遞藥系統，是由兩親性嵌段共聚物在水溶液中通過疏水作用力自發形成的超分子有序聚集體[6]，具有特殊的核-殼結構(疏水嵌段為內核，親水嵌段為外殼)。其內核作為載藥容器，能增溶難溶性藥物；而外殼可避免膠束被體內網狀內皮系統(reticulo-endothelial system，RES)識別和攝取，延長藥物在體內的循環時間，并保持其穩定。本實驗采用的泊洛沙姆(Poloxamer)，商品名為普蘭尼克(Pluronic)，是一種非離子型三嵌段共聚物，由聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯(PEO-PPO-PEO)組成，近年來在膠束載藥研究中備受關注。其分子量小于15 000 u，具有良好的生物相容性。本研究制備了槲皮素Pluronic P123/Poloxamer 188混合膠束，并初步考察其體外釋放特征及大鼠體內藥物代謝動力學行為，為該藥的新劑型研發提供新思路。

1 材料

1.1儀器ACQUTIY超高效液相色譜儀、e2695高效液相色譜儀(美國Waters公司)；UV-2100紫外可見分光光度計(北京萊伯泰科儀器有限公司)；3K30高速冷凍離心儀、4-1S低速離心儀(德國Sigma公司)；WH-2微型漩渦混合儀(上海滬西分析儀器廠)；旋轉蒸發儀(鞏義市英峪高科儀器廠)；H7650透射電鏡(日本HITACHI公司)；ZEN3690馬爾文粒度儀(Malvern公司)；RC8MD溶出試驗儀、RZQ-8D取樣收集系統(天津市天大天發科技有限公司)。

1.2藥物與試劑槲皮素(中國食品藥品檢定研究院)；Pluronic P123、Poloxamer 188(美國Sigma公司)；甲酸、乙腈(色譜純)，美國Fisher Scientific公司；吐溫-80(國藥集團化學試劑有限公司)。

1.3實驗動物10只健康SD大鼠，♂，體質量180～220 g，SPF級，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號：SCXK(京)2014-0004。

2 方法

2.1槲皮素混合膠束的制備采用薄膜分散法制備混合膠束，以包封率、載藥量為指標，單因素分別考察投藥量、P123質量分數、旋轉蒸發溫度、水浴溫度、水相用量對處方的影響，經[L9(34)]正交實驗優化，得制備方法為：稱取1 ∶1比例的Pluronic P123以及Poloxamer 188適量，槲皮素20 mg于圓底燒瓶中，加入丙酮混勻，磁力攪拌至完全溶解。50 ℃旋轉蒸發將有機溶劑揮盡，得干燥薄膜，室溫干燥過夜除去殘留溶劑。水浴加熱(40 ℃)藥膜1 h使膠束骨架溶解，得透明凝膠樣制劑，加入5 mL去離子水，繼續磁力攪拌水化，最終經0.22 μm微孔濾膜過濾得澄清黃色膠束溶液。分別通過透射電鏡、Malvern粒度分析儀測得膠束的外觀、粒徑及電位。

2.2體外釋放考察采用透析法考察膠束的體外釋放行為。參考文獻，釋放介質選用含1%吐溫-80的生理鹽水[7]，槲皮素在此介質中溶解度為(117.81±1.2)mg·L-1，滿足漏槽條件。分別精密吸取3.0 mL 槲皮素混合膠束溶液以及等量濃度的槲皮素溶液，置于已處理的透析袋(截留分子量為1 000 u)內，每組平行3份，將袋口扎緊后浸入釋放介質中，37 ℃、100 r·min-1條件下攪拌，且隔一定時間取樣2 mL，并補充等量新鮮介質。樣品過0.22 μm微孔濾膜后高效液相進樣，得藥物濃度。計算藥物累積釋放率，結果經DD Solver軟件進行模型擬合，并推測釋藥機制。

2.3大鼠體內藥物代謝動力學

2.3.1給藥方案 健康♂SD大鼠10只，隨機分成兩個實驗組(每組5只)：槲皮素溶液組與槲皮素混合膠束組。自由飲水，禁食24 h后，分別尾靜脈注射7.5 mg·kg-1的槲皮素溶液(精密稱取槲皮素 8 mg，加入0.8 mL無水乙醇混勻溶解，再次加入9.2 mL注射用水，并加入吐溫-80適量，超聲溶解后，過0.22 μm微孔濾膜得黃色透明槲皮素溶液)[8]以及槲皮素混合膠束。給藥后，兩組分別于 5、10、15、30、45、60、90、120 min眼眶后靜脈叢取血0.3 mL，置于肝素鈉抗凝管中。3 000 r·min-1離心10 min后，取上層血漿，-80 ℃保存。

2.3.2血漿樣品處理 取血漿樣品100 μL，加入1倍體積乙腈，渦旋60 s沉淀蛋白，于10 000 r·min-1離心10 min后取上清液，經0.22 μm微孔濾膜過濾后，放入-80 ℃冰箱保存待測。

2.3.3樣品測定方法的建立 色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm，愛爾蘭Waters)；流動相A：100%乙腈；流動相B：0.1%甲酸溶液；梯度洗脫：0～2 min，68% B；2～6 min，68%～10% B；流速0.3 mL·min-1；柱溫30 ℃；進樣量4 μL；檢測波長374 nm[9]。精密稱取槲皮素5.0 mg于50 mL容量瓶中，乙腈溶解并稀釋至刻度，配成濃度為100 mg·L-1儲備液。分別吸取不同濃度槲皮素儲備液加入大鼠空白血漿中混勻，得濃度為0.1、0.5、1、2、3、6、12、24 mg·L-1血漿樣品。經“血漿樣品處理”后，按色譜條件進樣。以濃度(C)對峰面積(A)作圖，進行線性回歸，求得回歸方程。

2.3.4方法學考察 配制含槲皮素0.3、3、12 mg·L-1的低、中、高濃度血漿樣品，考察精密度，方法回收率及萃取回收率[10]。

2.3.5數據分析 數據經PK Solver藥代動力學軟件處理，通過比較Rsqr_adj與AIC值，選出合適的房室模型，并計算藥動學參數，所有數據均需t檢驗進行兩兩比較。

3 結果

3.1體外測定方法經考察，混合膠束呈類圓形，藥物包埋于其中，無聚集現象，見Fig 1。制備的槲皮素混合膠束平均粒徑為(77.88±1.07)nm，電位為(-17.12±1.29)mV，包封率為(94.25±2.13)%，載藥量為(8.61±0.18)%。體外溶出線性方程為y=1 339.3x-291.54，r=0.9995，說明槲皮素在0.8～16 mg·L-1濃度范圍內線性關系良好。日內精密度RSD分別為1.45%、1.36%、0.95%，日間精密度RSD分別為1.80%、1.68%、1.37%，均滿足要求。

Fig 1 Transmission electronic microphotograph (TEM)image of mixed micelles(×20 000)

3.2體外釋放動力學

3.2.1體外釋放曲線 槲皮素以及槲皮素混合膠束在釋放介質中體外釋放曲線見Fig 2。數據表明，槲皮素及膠束在含1%吐溫-80介質中，累積釋放量分別為(83.65±3.97)%和(52.90±1.08)%。槲皮素溶液在9 min內完全釋放；而混合膠束則在72 h完全釋放。結果顯示，槲皮素混合膠束可延長藥物的釋放時間。

Fig 2 Release profiles of free quercetinand mixed micelles(n=3)

3.2.2體外釋放模型擬合 擬合結果見Tab 1。根據Rsqr_adj與AIC值對結果進行模型擬合(Rsqr_adj值越靠近1，AIC值越小則擬合度越高)，經擬合，游離槲皮素釋藥行為符合First-order方程，擬合方程為：F= 100·[1-Exp(-0.379·t)](Rsqr_adj=0.955 5，AIC=46.796 9)；槲皮素混合膠束釋藥行為符合Higuchi動力學方程，擬合方程為：F=6.735·t0.5(Rsqr_adj=0.960 4，AIC=75.584 0)。

Tab 1 Mathematical models of free quercetin andquercetin-loaded micelles to dissolution profiles

3.3大鼠體內藥物代謝動力學研究

Fig 3 Mean plasma concentration-time curves after intravenousinjection of quercetin solution and quercetin-loadedmixed micelles in rats(n=5)Tab 2 Main pharmacokinetic parameters of rats after intravenous administration of quercetin solution and quercetin-loaded mixed micelles (equivalent to 7.5 mg·kg-1 of quercetin)

ParameterQuercetin solutionQuercetin micellV/mL·μg-10.24±0.080.28±0.02T12α/min3.10±1.013.61±0.32T12β/min30.47±5.5434.88±22.78K21/min-10.049±0.0130.048±0.040K10/min-10.165±0.0520.093±0.002*K12/min-10.075±0.0080.068±0.039AUC0-t/μg·min·mL-1188. 70±28.21279.13±23.81**AUMC0-inf/μg·mL-1·min22 156.74±112.727 826.01±657.15**CL/mL·μg-1·min-10.037±0.0030.026±0.002**MRT0-inf/min11.22±0.8427.06±1.41**

*P<0.05，**P<0.01vsquercetin solution

4 討論

槲皮素不溶于水，因此在體外釋放實驗中選用普通溶出介質(雙蒸水、磷酸鹽緩沖液、生理鹽水等)時，幾乎檢測不到藥物。然而，選用40%乙醇作為釋放介質時，混合膠束溶解迅速，改變了槲皮素釋藥結果。因此，本文選用既滿足漏槽條件，又保證膠束穩定性的1%吐溫-80的生理鹽水為釋放介質。

釋放數據顯示，混合聚合物膠束能夠延長藥物的釋放時間，擬合結果為游離槲皮素釋藥行為符合First-order方程，槲皮素膠束釋藥行為符合Higuchi動力學方程。除常用動力學方程，本文采用Korsmeyer-Peppas模型對劑型進行擬合。此方程中指數項n值代表不同的釋藥機制：n<0.45時，釋放機制是擴散；0.450.89時，釋藥機制為骨架溶蝕[11-12]。混合膠束Korsmeyer-Peppas模型的n=0.526，在0.45

在建立超高效液相方法時，本實驗根據以往文獻選取不同的流動相比例，如乙腈-0.05%甲酸[13]、乙腈-0.1%甲酸[14]、乙腈-5%甲酸[15]。結果顯示，乙腈-0.05%甲酸與乙腈-5%甲酸分離效果均不滿意，藥物峰有嚴重拖尾，而乙腈-0.05%甲酸能夠很好分離藥物峰與血漿內容物，經過梯度洗脫后藥物峰峰型良好。因此，用此超高效液相方法分析樣品有快速、精準、簡便的優點。

用PK Solver軟件對大鼠靜脈注射兩種溶劑后的血藥濃度進行擬合，根據Rsqr_adj與AIC值判定房室模型種類。Rsqr_adj為校正的R2，Rsqr_adj值越靠近1，AIC值越小則擬合度越高。經擬合，兩種溶劑均為二室房室模型，且大多數擬合參數在統計學上差異有顯著性(P<0.05，P<0.01)。擬合結果充分說明混合膠束作為載藥體系，能夠增加槲皮素在體內時間，提高槲皮素的生物利用度。

本實驗制備的Pluronic P123/Poloxamer 188 槲皮素混合聚合物膠束粒徑小、包封率與載藥量高，延長了藥物在體外釋放時間，明顯提高槲皮素在體內的利用度。本研究為進一步研究槲皮素的混合膠束制劑體內的分布以及代謝產物提供了基礎。