柚皮素調節20-HETE改善糖尿病小鼠腎損傷

丁淑梅，張 杰，邱紅梅，黃 波，吳 芹，蔣青松

(1. 重慶醫科大學藥學院藥理學教研室，重慶市生物化學與分子藥理學重點實驗室，重慶 400016；2. 遵義醫學院基礎藥理學教育部重點實驗室暨特色民族藥教育部國際合作聯合實驗室，貴州 遵義 563003)

隨著社會經濟的不斷發展，糖尿病的發病率也逐年增加，嚴重影響了人們的生活水平和生命質量。糖尿病并發癥包括糖尿病心臟病、糖尿病肝病、糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)、糖尿病腦病等，是糖尿病患者出現殘疾，甚至死亡的主要原因。在我國，約65%的糖尿病患者出現嚴重的腎臟結構破壞和功能損傷，發生DN，進而發展為氮質血癥、尿毒癥，病人生活質量下降，經濟負擔加重。DN已成為終末期腎臟病的主要原因之一。國內外對DN的預防和治療已進行了大量研究，但仍缺乏針對性治療藥物和有效手段。柚皮素(naringenin，NAR)是柚皮苷的苷元，主要存在于蕓香科植物，如西紅柿與柚、橙等柑橘類水果中，具有抗菌、抗炎、抗氧化、抗腫瘤、保護腦缺血/再灌注損傷等多種藥理學活性[1]。在糖尿病大鼠模型，柚皮素具有降糖、抗炎、抗氧化、保護胰腺組織等作用[2]，但對其在糖尿病腎損傷的研究較少。

有研究發現，花生四烯酸(arachidonic acid，AA)經細胞色素P450(cytochrome P450，CYP450)氧化酶途徑代謝產物在代謝紊亂相關疾病中具有重要作用。20-羥-二十烷四烯酸(20-hydroxy eicosatetraenoic acid，20-HETE)是AA ω-羥化酶途徑經CYP4A/CYP4F催化生成的重要代謝產物，在糖尿病、心血管疾病、腫瘤等疾病的發生、發展過程中具有重要的作用[3]。在DN大鼠模型中，CYP4A表達和20-HETE生成增加，抑制20-HETE的生成對DN有保護作用[4]。但Luo等[5]的研究結果與之相反，在DN大鼠的腎小球，CYP4A表達和20-HETE產生明顯減少，氯貝特可上調CYP4A表達，增加20-HETE而產生腎保護作用。那么，20-HETE在糖尿病腎損傷中究竟具有怎樣的調節作用？這是一個需要深入研究的問題。另有研究發現，在DOCA-鹽誘導的高血壓大鼠模型，另一個貝特類藥物非洛貝特也可以上調CYP4A表達，增加20-HETE而產生降壓作用[6]。眾所周知，貝特類藥物是過氧化物酶體增殖物激活受體α(peroxisome proliferator activated receptor α，PPARα)激動劑。有趣的是，大量研究證實，柚皮素的作用與其對PPARα受體的激活有關[7]。那么，在糖尿病引起的腎臟損傷中，柚皮素的作用是否與20-HETE的變化有關？目前國內外未見相關報道。本研究擬利用高糖高脂飲食聯合鏈脲佐菌素(streptozocin，STZ)建立糖尿病模型，觀察柚皮素對糖尿病腎損傷的保護作用，以及20-HETE的變化情況。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 6～8周齡清潔級♂昆明小鼠，重慶醫科大學實驗動物中心提供，許可證號：SCXK(渝)20120001。

1.1.2試劑 柚皮素，純度98%，白色針狀結晶，用0.5%羧甲基纖維素鈉制成混懸液，購自成都德銳可生物科技有限公司，批號：drk-688-910714；STZ購自Sigma公司，批號：WXBC2544V；兔抗CYP4A多克隆抗體、鼠抗GAPDH單克隆抗體，購自美國Proteintech公司；小鼠20-HETE ELISA檢測試劑盒，購自上海江萊生物科技有限公司；ECL化學發光試劑盒購自美國Thermo公司；其余試劑均為國產分析純。

1.1.3儀器 AU5811全自動生化分析儀(美國貝克曼庫爾特有限公司)；ONETOUCH Ultra血糖儀(美國強生公司)；DENLEY DRAGON Wellscan MK 3酶標儀(美國Thermo公司)。

1.2方法

1.2.1糖尿病模型的建立 小鼠適應性喂養1 周后，用高糖高脂飲食喂養4 周，腹腔注射STZ(溶于pH 4.5的檸檬酸緩沖液中，現用現配)40 mg·kg-1·d-1，連續5 d。7 d后，用血糖儀測空腹血糖值(fasting blood glucose, FBG)。從40只小鼠中選取FBG≥11.1 mmol·L-1小鼠30只(繼續給予高糖高脂飲食)，隨機分成3組(每組10只)，分別為：模型組(DM)：給予等劑量的羧甲基纖維素鈉緩沖溶液；柚皮素低劑量組(NARL)、柚皮素高劑量組(NARH)：分別灌胃柚皮素25、75 mg·kg-1·d-1，持續4 周。正常組(NC，10只)：給予正常飼料喂養4周，連續5 d腹腔注射等劑量的枸櫞酸緩沖溶液，7 d后測血糖值，然后繼續用正常飼料飼養，同時灌胃等劑量的羧甲基纖維素鈉緩沖溶液4 周。

每周檢測小鼠的FBG和體質量，并用代謝籠收集尿液(檢測尿液體積和尿白蛋白含量)。給藥4 周后，眼眶取血，處死小鼠。立即取出腎臟并稱重，計算腎臟指數(腎質量/體質量)。分裝標本，液氮速凍后，保存于-80 ℃冰箱備用。

1.2.2腎功能指標檢測 將血液分裝后，室溫靜置30 min，4 ℃、3 000 r·min-1離心15 min，取血清凍存于-80 ℃冰箱備用。尿液于4 ℃、3 000 r·min-1離心15 min，取上清凍存于-80 ℃冰箱備用。用自動生化分析儀檢測血肌酐(serum creatinine, SCr)、尿素氮(urea nitrogen, BUN)和尿白蛋白的水平。

1.2.3Masson染色 腎臟組織置于4%的多聚甲醛中固定24 h，75%乙醇脫水，石蠟包埋，將其制作成切片。用Masson染色進行病理學檢查。使用ImageJ 1.43軟件測量腎小球橫斷面面積(glomerular cross-sectional area, GA)，計算平均腎小球體積(glomerular volume, GV)。每只小鼠取20個腎小球的面積，計算GV：GV=β/κ×GA3/2，其中β=1.38，為球體形狀系數；κ=1.1，為粒徑分布系數。每組取5只小鼠。

1.2.4透射電鏡 用冷刀片切取0.5 mm3腎組織，置于4%的戊二醛固定液中，4 ℃固定2 h，用PBS清洗3次，后經1%的四氧化鋨固定2 h，常規乙醇和丙酮梯度脫水，環氧樹脂浸透、包埋、聚合、切片，醋酸鈾和枸櫞酸鉛雙重染色，置于透射電鏡下觀察。

1.2.5Western blot檢測腎臟組織CYP4A蛋白的表達 稱取50 mg腎臟組織，加入0.5 mL RIPA裂解液，4 ℃勻漿。于4 ℃、12 000×g離心15 min，提取腎臟組織蛋白，BCA 法測定蛋白濃度。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜，封閉，加入一抗GAPDH (1 ∶2 000)、CYP4A (1 ∶1 000)，4 ℃過夜；TBST 洗膜，5 min×3次，二抗(1 ∶3 000)室溫孵育2 h，洗膜后加ECL發光試劑顯影，采用Image Lab 4.1進行檢測分析，蛋白相對表達量=目的蛋白條帶灰度/GAPDH條帶灰度，每組重復3次。

1.2.6ELASA檢測20-HETE含量 取血清，按照試劑盒說明書操作，于450 nm波長下，用酶標儀檢測20-HETE的水平。

2 結果

2.1柚皮素對糖尿病小鼠血糖的影響如Fig 1所示，給予STZ 7 d后，小鼠 FBG升高至(20.51±2.23)mmol·L-1(P<0.01)。在整個實驗期間，模型組FBG維持在較高的水平，NARL和 NARH組血糖水平略有下降(P<0.05)，但仍遠高于11.1 mmol·L-1的糖尿病診斷標準。

2.2柚皮素對糖尿病小鼠腎功能指標的影響如Tab 1所示，糖尿病形成4周后，模型小鼠BUN、肌酐、尿白蛋白明顯升高(P<0.01)，且尿白蛋白比正常組高23.47倍，提示糖尿病小鼠出現了腎損傷。柚皮素給藥劑量依賴地使糖尿病小鼠上述指標水平明顯下降(P<0.05)，NARL使尿白蛋白降低了48.45%，NARH組降低了56.81%。

Fig 1 Effect of naringenin on FBG of

**P<0.01vsNC group;#P<0.05,##P<0.01vsDM group

Tab 1 Effect of naringenin on BUN, SCr

**P<0.01vsNC;#P<0.05,##P<0.01vsDM

2.3柚皮素對糖尿病小鼠腎臟病理的影響與正常組比較，糖尿病形成4周后，糖尿病小鼠腎臟指數(Fig 2)、腎小球體積(Fig 3C)明顯增大(P<0.01)；柚皮素給藥明顯減少糖尿病小鼠的腎臟肥大(P<0.01)。Masson染色顯示，DM小鼠腎小球中大量膠原纖維相互交連成網，細胞間質膠原纖維增生，腎小管出現擴張，空泡變性(Fig 3A)。電鏡結果表明，模型小鼠腎臟基底膜不均勻增厚，足突部分融合，系膜基質增加(Fig 3B)。柚皮素給藥4周后，糖尿病小鼠腎臟上述病理變化明顯改善。

Fig 2 Effect of naringenin on kidney index of

**P<0.01vsNC group;##P<0.01vsDM group

A:Masson staining(×400);B:Transmission electron microscopic examination(×10 000);C:Glomerular volume of mice. BM: basement membrane; FP: foot processes; Mes: mesangial cell; RBC: red blood cell.**P<0.01vsNC group;##P<0.01vsDM group.

2.4柚皮素對糖尿病小鼠腎臟CYP4A蛋白和20-HETE的影響如Fig 4、5所示，與正常組比較，糖尿病小鼠腎臟CYP4A蛋白表達減少了44.44%(P<0.01)，血清20-HETE的含量降低了45.09%(P<0.01)；柚皮素低、高劑量組使CYP4A蛋白表達分別增加了0.13和0.65倍(P<0.05)，20-HETE的含量分別升高了0.22和0.46倍(P<0.05)。

Fig 4 Effect of naringenin on CYP4A

**P<0.01vsNC group;#P<0.05,##P<0.01vsDM group

Fig 5 Effect of naringenin on 20-HETE levels in serum of

**P<0.01vsNC group;#P<0.05,##P<0.01vsDM group

3 討論

DN是糖尿病引起的危害性最大的一種慢性并發癥，是糖尿病全身性微血管病變表現之一，臨床特征為蛋白尿、漸進性腎功能損害、高血壓等，晚期出現嚴重腎功能衰竭，是導致糖尿病患者死亡的主要原因。目前，DN的發病機制尚不清楚，也無任何藥物獲FDA批準用于該病的治療。目前，西方醫學對DN的治療缺乏有效措施，相比較而言，傳統中醫藥展現出較大治療優勢。植物藥，即中草藥提取的活性成分，如人參多糖[8]、黃芪多糖[9]、桑葉總黃酮[10]等對DN均有一定療效。柚皮素廣泛存在于天然植物中，具有多種藥理學活性，可用于肥胖、高血壓、高脂血癥、糖尿病等代謝綜合征癥候群的治療。在糖尿病整體動物及細胞培養模型，柚皮素除能降糖調脂外，對糖尿病并發的肝、腎損害及血管內皮功能障礙等亦有改善作用[11]。本實驗利用高糖高脂飲食聯合多次腹腔注射小劑量STZ，誘導小鼠形成糖尿病。4 周后，糖尿病小鼠的BUN、SCr、尿白蛋白均升高，且尿白蛋白比正常組高出10倍以上，達到糖尿病并發癥聯盟網站(AMDCC)所提出的DN動物模型建立標準。同時，腎臟肥大，出現膠原纖維增加、基底膜增厚、足突部分融合等腎臟病理改變。腎功能和病理學檢查均提示，糖尿病小鼠出現明顯腎臟損傷。柚皮素給藥4周劑量依賴地改善模型小鼠腎臟結構和功能的惡化，明顯延緩糖尿病小鼠的腎臟損傷。另外，給予柚皮素治療后，糖尿病小鼠FBG雖然有所降低，但仍遠大于11.1 mmol·L-1的糖尿病診斷標準，提示柚皮素有一定程度降低血糖的作用，但對血糖水平的控制不是其產生腎臟保護作用的根本原因。

DN的發病機制較為復雜，炎癥及其相關信號通路的作用在其中具有重要意義。眾所周知，AA及其代謝產物是重要的炎癥介質。AA的環氧化酶和脂氧化酶代謝途徑已被廣泛研究和了解，其產物如前列腺素類和白三烯類等，在炎癥和代謝調節中有重要作用。近年，AA另一條代謝途徑——CYP氧化酶途徑代謝的生物學及病理生理學意義也逐漸被認識和重視。20-HETE是AA CYP氧化酶途徑代謝產物之一，也參與了炎癥、心血管系統疾病、糖尿病等的病理過程[3]。有趣的是，現在對20-HETE的研究呈現了矛盾的結果。有文獻表明，在STZ誘導的糖尿病大鼠腎臟中，CYP4A和20-HETE的產生均明顯降低，甚至20-HETE 水平只有正常大鼠的1/5。而且，內源性和外源性的20-HETE對腎小球通透性屏障具有保護作用，可減輕蛋白尿，延緩腎纖維化的進程[5,12]。但有一些研究提出了相反的結果，在STZ誘導的糖尿病腎臟的微粒體中，CYP4A的表達和功能明顯增加[4]。本研究結果顯示，糖尿病小鼠出現腎臟損傷同時，CYP4A蛋白表達下調，20-HETE含量較正常組明顯減少，與Luo等[5]和John等[12]的研究一致。出現不同研究結果的原因可能是由于動物種屬的差異、建模的方法、觀察的組織器官、實驗條件等不同所致。

目前，對于柚皮素在DN中的作用研究較少，相關機制主要集中于炎癥、氧化應激等方面[13]，而柚皮素與20-HETE之間的作用未見報道。Senol等[14]的研究顯示，20-HETE類似物5,14-HEDGE通過激活PPARα/β/γ，對感染性休克引起的低血壓、心動過速及炎癥有保護作用。另有研究發現，PPARα可能介導了20-HETE對炎癥因子，如COX-2、IL-6的抑制作用[6]。這些研究提示，20-HETE的作用與PPARs的激活可能有一定關系。值得注意的是，現有研究認為，PPARs受體也介導了柚皮素的藥理活性[15]。因此，我們推測，柚皮素的作用可能與其對20-HETE的調節有關。本研究結果顯示，柚皮素干預后，糖尿病小鼠腎損傷改善的同時，腎臟CYP4A蛋白表達上調，20-HETE含量亦明顯升高。

綜上所述，本實驗條件下，柚皮素對糖尿病小鼠腎損傷有保護作用，該作用的發生可能與柚皮素上調CYP4A表達，增加20-HETE含量有關。由于CYP在體內分布的廣泛性和作用的復雜性，柚皮素對CYP4A-20-HETE的作用還需進行更多深入研究。

(致謝：本文實驗在重慶醫科大學藥學院生物化學與分子藥理學重點實驗室完成，特此致謝！)