miR-27a-3p通過(guò)Wnt3a/β-catenin信號(hào)通路抑制肺成纖維細(xì)胞I、III型膠原合成

劉理靜，錢 紅，胡 柯，張自珍，賀兼斌

(1. 湖南醫(yī)藥學(xué)院醫(yī)學(xué)院，湖南 懷化 418000；2. 湖南環(huán)境生物職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)院，湖南 衡陽(yáng) 421001；3. 懷化市第一人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，湖南 懷化 418000)

肺纖維化是一種慢性、進(jìn)行性、致死性的肺間質(zhì)疾病，目前尚缺乏特效治療方法。I型膠原(collagen type Ⅰ,Col Ⅰ)和Ⅲ型膠原(collagen type Ⅲ,Col Ⅲ)是細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，在肺組織中由肺成纖維細(xì)胞合成與分泌，受到JAK/STAT3、TGF-β1/ADAMTS-1、PI3K/Akt等信號(hào)通路的調(diào)控，其過(guò)度蓄積是肺纖維化的特征性病理改變[1-2]。Wnt3a/β-catenin信號(hào)通路是一條經(jīng)典的致纖維化途徑，激活后可促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)合成[3-4]。microRNAs(miRNAs)是一類長(zhǎng)度為19～25個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼RNA，通過(guò)與靶mRNA的3′-非翻譯區(qū)(3′-untranslated region, 3′-UTR)結(jié)合，導(dǎo)致其翻譯過(guò)程受到抑制或引起mRNA的降解，在轉(zhuǎn)錄后水平負(fù)性調(diào)控基因表達(dá)。大量研究表明，miRNAs 失調(diào)與肺纖維化的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[5-6]。miR-27a-3p是miR-27家族的一個(gè)重要成員，屬于基因間miRNA。Cui等[7]報(bào)道，miR-27a-3p通過(guò)抑制肺成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞分化，減輕小鼠肺纖維化，表明 miR-27a-3p是一種抗肺纖維化因子。然而，miR-27a-3p是否通過(guò)Wnt3a/β-catenin途徑調(diào)控細(xì)胞外基質(zhì)代謝，尚不清楚。為此，本研究以人胚肺成纖維細(xì)胞MRC-5為研究對(duì)象，觀察miR-27a-3p模擬物/抑制物轉(zhuǎn)染對(duì)Col I、Col III、Wnt3a、β-catenin表達(dá)的影響，從新的角度闡明miR-27a-3p抗肺纖維化作用。

1 材料與方法

1.1試劑miR-27a-3p模擬物/抑制物及相應(yīng)的陰性對(duì)照物，由廣州銳博公司合成；新生胎牛血清和RPMI 1640培養(yǎng)基，購(gòu)于Gibco公司；LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑、TRIzol試劑，美國(guó)Invitrogen公司；Dickkopf相關(guān)蛋白1(Dickkopf-related protein 1, Dkk1)，購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；SYBR Green Real Time PCR Master Mix，日本 Toyobo公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、pGL3載體，美國(guó)Promega公司產(chǎn)品；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒、RIPA細(xì)胞裂解液、細(xì)胞質(zhì)/核蛋白提取試劑盒，上海碧云天生物技術(shù)有限公司；兔抗人Col Ⅰ、Col Ⅲ、Wnt3a、β-catenin、β-actin單克隆抗體，購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)MRC-5細(xì)胞和HEK293T細(xì)胞，購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。MRC-5細(xì)胞復(fù)蘇后，接種于含10%新生胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，并置入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至融合狀態(tài)后，以0.25%的胰蛋白酶消化，并進(jìn)行傳代培養(yǎng)。當(dāng)培養(yǎng)細(xì)胞達(dá)到一定數(shù)量，且呈現(xiàn)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)時(shí)用于相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

1.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染與處理取上述MRC-5細(xì)胞接種于24孔板中，每孔細(xì)胞數(shù)約為1×106，加入0.18 mL RPMI 1640培養(yǎng)液，并繼續(xù)孵育24 h，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到85%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，分為對(duì)照組、模擬物對(duì)照組、miR-27a-3p模擬物組、抑制物對(duì)照組和miR-27a-3p抑制物組。按照LipofectamineTM2000的操作說(shuō)明，分別給予培養(yǎng)液或者40 nmol·L-1的模擬物陰性對(duì)照物、miR-27a-3p模擬物、抑制物陰性對(duì)照物、miR-27a-3p抑制物轉(zhuǎn)染細(xì)胞48 h。為了探討Wnt3a/β-catenin信號(hào)通路在miR-27a-3p調(diào)控Col Ⅰ和Col Ⅲ表達(dá)中的作用，先以10 μmol·L-1Dkk1處理MRC-5細(xì)胞6 h，再用40 nmol·L-1的miR-27a-3p抑制物轉(zhuǎn)染48 h。待處理完畢后，檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)。

1.4生物信息學(xué)預(yù)測(cè)和雙熒光素酶報(bào)告基因分析利用Targetscan(http://www.targetscan.org/)和miRDB(http://mirdb.org/miRDB/)，預(yù)測(cè)miR-27a-3p與Wnt3a 3′-UTR的靶向結(jié)合情況。在此基礎(chǔ)上，利用PCR從MRC-5細(xì)胞基因組DNA中擴(kuò)增Wnt3a的3′-UTR序列，插入熒光素酶報(bào)告載體pGL3，同時(shí)構(gòu)建其突變載體，使用LipofectamineTM2000將上述質(zhì)粒(1 μg)與40 nmol·L-1的miR-27a-3p模擬物或模擬物陰性對(duì)照物共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞48 h，雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒測(cè)定各組細(xì)胞熒光素酶活性。

1.5實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitativereal-timePCR,qPCR) 采用TRIzol試劑提取MRC-5細(xì)胞中的總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。qPCR所使用的引物由上海生工生物工程公司合成，其中miR-27a-3p引物序列：上游5′-TGCGGTTCACAGTGGCTAAG-3′，下游5′-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3′；U6引物序列：上游5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；Col I引物序列：上游5′-CTCTTGCTGCTGCTCCCTAC-3′，下游5′-CCACCCCAGGGATAAAAACTGC-3′；Col Ⅲ引物序列：上游5′-GAATGGTGGCTTTCAGTTCAGC-3′，下游5′-GCTGTTTTTGCAGTGGTATGTAATG-3′；Wnt3a引物序列：上游5′-CAGTGCCTCGGAGATGGTG-3′，下游5′-GGTTAGGTTCGCAGAAGTTGG-3′；GAPDH引物序列：上游5′-TGGGTGTGACCATGAGAAGT-3′，下游5′-TGAGTCCTTCCACGATACCAA-3′。在Roche480熒光實(shí)時(shí)定量PCR儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性30 s，55 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸2 min，總共35個(gè)循環(huán)。用ΔΔCt值法定量目的基因miR-27a-3p、Col Ⅰ、Col Ⅲ和Wnt3a表達(dá)水平。

1.6Westernblot細(xì)胞處理完畢后，RIPA細(xì)胞裂解液處理MRC-5細(xì)胞，并用細(xì)胞質(zhì)/核蛋白提取試劑盒提取蛋白，BCA法定量，然后上樣、電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，分別加入兔抗人Col Ⅰ(1 ∶500)、Col Ⅲ(1 ∶500)、Wnt3a(1 ∶500)、β-catenin(1 ∶500)、β-actin(1 ∶2 500)一抗，4 ℃孵育過(guò)夜，TBS洗滌后，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1 ∶2 500)二抗，37 ℃孵育1 h，化學(xué)發(fā)光法顯色，暗室曝光。通過(guò)Labwork凝膠圖像分析系統(tǒng)掃描所有膠片，計(jì)算目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1miR-27a-3p轉(zhuǎn)染效率檢測(cè)為了鑒定miR-27a-3p模擬物/抑制物的轉(zhuǎn)染效率，分別以40 nmol·L-1miR-27a-3p模擬物/抑制物及其陰性對(duì)照物轉(zhuǎn)染MRC-5細(xì)胞48 h，qPCR檢測(cè)miR-27a-3p表達(dá)。如Fig 1所示，miR-27a-3p過(guò)表達(dá)明顯增加miR-27a-3p水平(P<0.01)，miR-27a-3p抑制則明顯降低miR-27a-3p水平(P<0.01)，而陰性對(duì)照物對(duì)其表達(dá)無(wú)影響(P>0.05)，提示miR-27a-3p模擬物/抑制物轉(zhuǎn)染MRC-5細(xì)胞具有較高的效率。

Fig 1 Expression of miR-27a-3p in

1: Control group; 2: Mimic control group; 3: miR-27a-3p mimic group; 4: Inhibitor control group; 5: miR-27a-3p inhibitor group.**P<0.01vscontrol group.

2.2miR-27a-3p抑制MRC-5細(xì)胞ColⅠ、ColⅢ表達(dá)給予miR-27a-3p模擬物/抑制物轉(zhuǎn)染MRC-5細(xì)胞48 h，qPCR、Western blot檢測(cè)Col Ⅰ、Col Ⅲ mRNA與蛋白表達(dá)。相對(duì)于對(duì)照組，miR-27a-3p模擬物明顯減少Col Ⅰ、Col Ⅲ mRNA與蛋白表達(dá)(P<0.01)，而其抑制物則增加Col Ⅰ、Col Ⅲ mRNA與蛋白表達(dá)(P<0.01)，見(jiàn)Fig 2。

1:Control group;2:Mimic control group; 3: miR-27a-3p mimic group; 4: Inhibitor control group; 5: miR-27a-3p inhibitor group.**P<0.01vscontrol group.

2.3鑒定Wnt3a為miR-27a-3p的靶基因生物信息學(xué)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，Wnt3a 3′-UTR存在1個(gè)miR-27a-3p的結(jié)合位點(diǎn)(Fig 3)。Fig 4的熒光素酶報(bào)告基因顯示，miR-27a-3p模擬物減少野生型Wnt3a 3′-UTR熒光素酶活性(P<0.01)，但不影響突變型熒光素酶活性(P>0.05)。這些結(jié)果表明，Wnt3a為miR-27a-3p的靶基因。

Fig 3 Binding site for miR-27a-3p in Wnt3a 3′-UTR and its mutant

Fig 4 Comparison of luciferase activity among

1:Control group;2:Wnt3a 3′-UTR wild type group;3:Wnt3a 3′-UTR mutant group.**P<0.01vsmimic control.

2.4miR-27a-3p下調(diào)MRC-5細(xì)胞Wnt3a表達(dá)以miR-27a-3p模擬物/抑制物轉(zhuǎn)染MRC-5細(xì)胞，處理48 h后，用qPCR和Western blot檢測(cè)Wnt3a表達(dá)。如Fig 5所示，miR-27a-3p過(guò)表達(dá)明顯降低Wnt3a蛋白水平(P<0.01)，miR-27a-3p抑制則增加Wnt3a蛋白水平(P<0.01)，但對(duì)其mRNA表達(dá)無(wú)影響(P>0.05)。提示miR-27a-3p在翻譯水平抑制Wnt3a表達(dá)。

2.5miR-27a-3p降低MRC-5細(xì)胞核內(nèi)β-catenin表達(dá)β-catenin是Wnt3a的關(guān)鍵下游分子，在激活狀態(tài)下，β-catenin在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)大量聚集，并進(jìn)入細(xì)胞核，從而促進(jìn)靶基因轉(zhuǎn)錄。接下來(lái)，檢測(cè)miR-27a-3p對(duì)胞核β-catenin表達(dá)的影響。Fig 6的Western blot結(jié)果顯示，miR-27a-3p模擬物轉(zhuǎn)染MRC-5細(xì)胞48 h明顯下調(diào)β-catenin表達(dá)，其抑制物表現(xiàn)出相反的作用，與對(duì)照組比較，差異均有顯著性(P<0.01)。提示miR-27a-3p阻滯β-catenin激活。

Fig 5 Effects of miR-27a-3p on Wnt3a mRNA(A) and protein(B) expression in MRC-5

1:Control group; 2: Mimic control group; 3: miR-27a-3p mimic group; 4: Inhibitor control group; 5: miR-27a-3p inhibitor group.**P<0.01vscontrol group.

2.6miR-27a-3p通過(guò)拮抗Wnt3a/β-catenin信號(hào)通路減少ColⅠ、ColⅢ生物合成為了闡明miR-27a-3p降低Col I、Col III產(chǎn)生的分子機(jī)制，以Wnt3a/β-catenin信號(hào)通路抑制劑Dkk1預(yù)處理MRC-5細(xì)胞6 h，再用miR-27a-3p抑制物轉(zhuǎn)染細(xì)胞48 h。如Fig 7所示，相對(duì)于對(duì)照組，miR-27a-3p抑制物組Col Ⅰ、Col Ⅲ表達(dá)水平明顯增加(P<0.01)，Dkk1預(yù)處理后，加入miR-27a-3p抑制物，Col Ⅰ、Col Ⅲ表達(dá)水平較miR-27a-3p 抑制物組降低(P<0.05)，表明miR-27a-3p對(duì)Col Ⅰ、Col Ⅲ合成的抑制作用通過(guò)Wnt3a/β-catenin途徑介導(dǎo)。

3 討論

在正常的肺組織中，細(xì)胞外基質(zhì)的合成代謝與分解代謝處于動(dòng)態(tài)平衡之中，從而維持肺組織的正常結(jié)構(gòu)與呼吸功能。在致纖維化因素的作用下，肺成纖維細(xì)胞大量生成細(xì)胞外基質(zhì)，特別是Col Ⅰ和Col Ⅲ，使其合成代謝超過(guò)分解代謝，并在肺組織中不斷沉積，這是肺纖維化形成過(guò)程中最重要的病理改變。miR-27a-3p是一種多效性的miRNA，調(diào)控血管生成、能量代謝及細(xì)胞增殖、遷移、分化等生物學(xué)過(guò)程，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[8-9]。近年研究發(fā)現(xiàn)，miR-27a-3p也能抑制肺纖維化進(jìn)展[7]，但機(jī)制未明。本研究中，miR-27a-3p過(guò)表達(dá)明顯降低MRC-5細(xì)胞Col Ⅰ和Col Ⅲ水平，其抑制則上調(diào)Col Ⅰ和Col Ⅲ表達(dá)，表明miR-27a-3p負(fù)性調(diào)控細(xì)胞外基質(zhì)合成，這揭示了一個(gè)新的miR-27a-3p抗肺纖維化機(jī)制。

Fig 6 Effects of miR-27a-3p on nuclear β-catenin expression in MRC-5

1:Control group; 2: Mimic control group; 3: miR-27a-3p mimic group; 4: Inhibitor control group; 5: miR-27a-3p inhibitor group.**P<0.01vscontrol group.

Wnt信號(hào)通路包括3條，其中Wnt3a/β-catenin途徑主要調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄。在激活狀態(tài)下，Wnt3a抑制β-catenin的泛素化降解，使細(xì)胞質(zhì)中β-catenin含量增加，并移位至細(xì)胞核，與轉(zhuǎn)錄因子T細(xì)胞因子/淋巴增強(qiáng)因子結(jié)合，進(jìn)而誘導(dǎo)Col Ⅰ、Col Ⅲ等靶基因表達(dá)[10-11]。在特發(fā)性肺纖維化患者的肺泡上皮中，Wnt3a、β-catenin表達(dá)明顯增加[12-13]。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1通過(guò)抑制miR-29表達(dá)，激活Wnt3a/β-catenin信號(hào)通路，促進(jìn)肺成纖維細(xì)胞合成Col Ⅰ[3]。另一方面，使用Wnt3a/β-catenin信號(hào)通路的抑制劑Dkk1能明顯改善小鼠肺纖維化程度[14]。因此，Wnt3a/β-catenin 信號(hào)通路在肺纖維化發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用，尋找調(diào)控這條途徑的潛在機(jī)制對(duì)于肺纖維化的防治具有重要價(jià)值。

Fig 7 Effects of Dkk1 combined with miR-27a-3p inhibitor on Col Ⅰ and Col Ⅲ mRNA(A) and protein(B) expression in MRC-5

1:Control group; 2: miR-27a-3p inhibitor group; 3: Dkk1 group; 4: Dkk1+miR-27a-3p inhibitor group.**P<0.01vscontrol group;#P<0.05vsmiR-27a-3p inhibitor group.

miRNAs必須與其靶mRNA 3′-UTR結(jié)合才能發(fā)揮生物學(xué)功能。已有研究表明，miR-27a-3p通過(guò)靶向沉默Wnt3a，抑制β-catenin核轉(zhuǎn)位，從而減少小鼠皮膚黑色素生成[15]。與此相似，本研究通過(guò)生物信息學(xué)在線網(wǎng)站，發(fā)現(xiàn)Wnt3a 3′-UTR存在miR-27a-3p的結(jié)合位點(diǎn)，而且miR-27a-3p模擬物減少野生型Wnt3a 3′-UTR熒光素酶活性，但對(duì)其突變型無(wú)影響，進(jìn)一步證實(shí)Wnt3a為miR-27a-3p的靶基因。同時(shí)，miR-27a-3p模擬物轉(zhuǎn)染MRC-5細(xì)胞后，Wnt3a、β-catenin表達(dá)水平明顯降低，其抑制物的作用則相反，表明miR-27a-3p為Wnt3a/β-catenin信號(hào)通路的負(fù)性調(diào)控子。Kim等[16]用siRNA干擾β-catenin表達(dá)，發(fā)現(xiàn)Wnt3a/β-catenin信號(hào)通路失活，抑制細(xì)胞外基質(zhì)合成，進(jìn)而緩解博萊霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化。為了揭示miR-27a-3p調(diào)控MRC-5細(xì)胞Col Ⅰ、Col Ⅲ表達(dá)的分子機(jī)制，以Dkk1和/或miR-27a-3p抑制物處理MRC-5細(xì)胞，Dkk1預(yù)處理廢除miR-27a-3p抑制物對(duì)Col Ⅰ、Col Ⅲ表達(dá)的影響，提示W(wǎng)nt3a/β-catenin信號(hào)通路介導(dǎo)miR-27a-3p對(duì)MRC-5細(xì)胞Col Ⅰ、Col Ⅲ合成的抑制作用。

綜上所述，miR-27a-3p通過(guò)靶向沉默Wnt3a，抑制β-catenin核轉(zhuǎn)位，從而下調(diào)肺成纖維細(xì)胞Col Ⅰ、Col Ⅲ表達(dá)，這從細(xì)胞外基質(zhì)代謝角度揭示了新的miR-27a-3p抗肺纖維化機(jī)制。外源性給予miR-27a-3p模擬物或刺激其內(nèi)源性生成可能成為肺纖維化防治的新策略。

(致謝：本實(shí)驗(yàn)在侗醫(yī)藥研究湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室和湖南環(huán)境生物職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心完成，感謝各位老師的指導(dǎo)和幫助。)