線粒體凋亡通路在棕櫚酸誘導的血管內皮細胞凋亡中的作用

許文虎，金春子，王曉龍，陳 晨，崔 蘭

(延邊大學附屬醫院 1. 心血管內科、2. 中心實驗室，吉林 延吉 133000)

動脈粥樣硬化是一種以動脈血管壁內脂質斑塊不斷累積為特征的慢性、進展性疾病[1-2]。在動脈粥樣硬化的發病及外周血管疾病、腦卒中、冠狀動脈疾病等并發癥產生過程中，病理性血脂因素已經成為了關鍵的危險因素[3-4]。血脂異常一般是指血中致動脈粥樣硬化的脂質——總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇、三酰甘油、載脂蛋白B和脂蛋白A增高，而抗動脈粥樣硬化的脂質——高密度脂蛋白膽固醇和載脂蛋白A降低。大量循證醫學資料證明，積極調脂治療可明顯減少致死性和非致死性心肌梗死發生的風險，以及冠心病的致殘率和致死率，并降低對經皮冠狀動脈介入治療和冠脈旁路移植術的需求，調脂治療已成為動脈粥樣硬化預防策略中最重要的措施之一[5-6]。棕櫚酸(palmitic acid，PA)又稱軟脂酸，是一種飽和高級脂肪酸，以甘油酯的形式普遍存在于動植物油脂中，在自然界中分布很廣，通常用于建立脂毒性細胞模型和動物模型。因此，本研究以PA誘導建立人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)脂毒性損傷模型，分析其機制與線粒體凋亡通路的相關性，為內皮細胞脂毒性損傷研究奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞系 HUVECs購自上海基免實業有限公司。

1.1.2試劑 凋亡誘導因子(apoptosis inducing factor，AIF)、細胞色素C(cytochrome C，Cyt-C)、cleaved caspase-3、Bcl-2、Bax抗體，均購自美國Abcam公司；TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒，購自羅氏公司；活性氧(reactive oxygen species，ROS)檢測試劑盒、MTT檢測試劑盒，均購自碧云天公司；DMEM培養基、胎牛血清、胰酶，均購自美國Gibco公司； PA、線粒體通透性抑制劑環孢素A (ciclosporine A，CsA)，均購自Sigma公司。

1.1.3儀器 電泳槽、電轉膜儀(Bio-Rad公司)；高速冷凍離心機(德國Sigma公司)；多功能酶標儀(上海沛歐分析儀器有限公司)；熒光顯微鏡、倒置顯微鏡(日本奧林巴斯公司)；二氧化碳培養箱(上海皓莊儀器有限公司)；紫外分光光度計(上海奧析科學儀器)；化學發光凝膠成像系統(美國ProteinSimple公司)。

1.2方法

1.2.1PA的配制 水浴鍋溫度保持至37 ℃，稱取PA溶于無水乙醇中，使母液濃度達到100 mmol·L-1，-20 ℃長期保存，避免反復凍融,可少量多管分裝。或在37 ℃水浴條件下，將其溶于0.5% BSA的高糖DMEM(含血清、雙抗)，渦旋混勻，濾膜過濾后使用，4 ℃冰箱保存。

1.2.2細胞培養 從液氮中取出細胞，接種于DMEM高糖培養基(含25 mmol·L-1的葡萄糖、10%胎牛血清、100×青霉素-鏈霉素溶液)中，在37 ℃、5% CO2培養箱培養24～48 h后，更換培養液，直至細胞生長密度達到70%～80%時，用0.25% 含EDTA的胰酶輕輕吹打消化、傳代至所需培養皿中，進行實驗研究。

1.2.3實驗分組 實驗分組分三類：濃度梯度測試PA(0.1、0.2、0.4、0.8 mmol·L-1)；時間梯度測試(0、12、24、48 h)；抑制劑實驗分為對照組，0.4 mmol·L-1PA組，以及10 μmol·L-1CsA預處理2 h后，再給予0.4 mmol·L-1PA組。

1.3檢測指標

1.3.1MTT檢測細胞增殖率 以每孔含1×106個細胞為標準，接種于96孔板中(設立6個復孔)，置CO2培養箱孵育，待細胞貼壁牢固，換為含PA的培養基，繼續培養至所設定時間，然后吸棄上清液，每孔加入5 g·L-1的MTT 20 μL，將96孔板放置CO2培養箱培養4 h后，棄去上清液，每孔加入DMSO 150 μL，用酶標儀測各孔OD值。細胞活力=OD處理孔/OD陰性對照孔×100%。

1.3.2ROS含量的檢測 HUVECs接種6孔細胞培養板，當細胞貼壁生長至70%～80%融合度，按組別給藥后，培養箱內孵育24 h，PBS反復沖洗后，細胞培養板內加入10 mmol·L-1DCFH-DA，培養箱內孵育30 min，PBS反復沖洗后，采用熒光顯微鏡進行拍照，并用ImageJ 1.41軟件分析綠色熒光強度。

1.3.3Western blot法檢測線粒體凋亡通路蛋白表達水平 把分組好的實驗細胞放5% CO2培養箱培養，24 h后，PBS洗去細胞雜質，每皿加入裂解液充分裂解細胞，細胞刮刀收集于離心管，離心后收集上清，用BCA試劑盒測定蛋白含量。根據所測濃度，等體積上樣于5%～15%的SDS-PAGE凝膠，電泳進行分離，冰浴下濕法轉移至PVDF膜2 h，用5%的脫脂奶粉室溫搖床封閉1 h，加入對應一抗4 ℃搖床孵育過夜。次日換為HRP標記的二抗，室溫孵育1 h，用ECL化學發光顯影，然后凝膠成像系統檢測AIF、Cyt-C、cleaved caspase-3、Bcl-2、Bax、β-actin的表達水平。

1.3.4TUNEL檢測細胞凋亡 培養皿細胞長滿到90%，胰酶消化細胞，收集于15 mL離心管，離心5 min，加入培養基使細胞被吹打成細胞懸液，每孔500 μL，接種于鋪有爬片的24孔板內，放CO2培養箱培養。貼壁細胞融合度達到70%～80%時，給予PA，繼續孵育24 h，PBS反復沖洗后，4%多聚甲醛固定，采用TUNEL凋亡試劑盒染色，熒光顯微鏡下實時觀察，進行拍照。

2 結果

2.1PA對HUVECs細胞增殖的影響體外培養細胞，用含PA (0.1、0.2、0.4、0.8 mmol·L-1)的DMEM培養基刺激24 h。如Fig 1A所示，隨著PA濃度的增加，HUVECs增殖率呈下降趨勢，PA濃度在0.4 mmol·L-1時開始明顯降低(P<0.01)；Fig 1B結果顯示，含PA 0.4 mmol·L-1的DMEM培養基刺激細胞0、12、24、48 h后，隨著刺激時間的延長，細胞數量明顯減少，刺激細胞24 h后的數據差異均具有統計學意義(P<0.01)，其中在刺激細胞24 h時，開始明顯降低(P<0.01)。因此，我們將PA濃度定為0.4 mmol·L-1，刺激時間定為24 h開展后續實驗。

Fig 1 Influence of PA on cell viability in HUVECs n=5)

A: Cell viability was significantly suppressed when PA concentration increased to 0.4 mmol·L-1.**P<0.01vs0 mmol·L-1group; B: HUVECs were treated with 0.4 mmol·L-1PA for different time, and inhibition of cell viability was calculated from MTT assay.##P<0.01vs0 h group

2.2PA刺激對HUVECs細胞內ROS水平的影響如Fig 2所示，0.4 mmol·L-1PA刺激0、12、24、48 h 后，刺激時間在24～48 h時，細胞內ROS的水平出現高表達狀態，而24 h PA刺激組與48 h PA刺激組之間的ROS水平差異無顯著性(P>0.05)。

Fig 2 Effects of PA on ROS of HUVECs (scale bar: 50 μm)

The intracellular level of ROS in HUVECs was estimated by DCFH-DA, a fluorescent probe. DHE is green fluorescence. Fluorescence images of HUVECs stained with DHE after cells were incubated for 0 h (A), 12 h (B), 24 h (C) and 48 h (D) with 0.4 mmol·L-1PA.

2.3PA對HUVECs細胞線粒體凋亡通路蛋白表達的影響如Fig 3所示，用含0.4 mmol·L-1PA的DMEM培養基刺激細胞24 h，與正常對照組相比，Bcl-2表達水平明顯下降(P<0.05)，而AIF、Cyt-C、cleaved caspase-3、Bax等線粒體凋亡通路蛋白表達在高脂刺激24 h后均出現高表達，高于正常對照組(P<0.05)；而24、48 h PA刺激組之間的線粒體凋亡通路蛋白表達差異均無顯著性(P>0.05)。

2.4PA對HUVECs細胞凋亡的影響如Fig 4所示，在顯微鏡下觀察到細胞的紅色熒光強度與給藥時間呈正比，隨著給藥時間的延長，紅色熒光增強，提示細胞凋亡增加。PA刺激24 h時，細胞呈現明顯的固縮現象，表現出明顯的凋亡相關形態學改變，其中PA刺激24 h與48 h相比，熒光強度差異無顯著性。

2.5線粒體凋亡通路與PA所致HUVECs細胞損傷的相關性如Fig 5所示，在顯微鏡下觀察到0.4 mmol· L-1PA刺激24 h時細胞的紅色熒光明顯增強，提示細胞凋亡明顯增加。給予線粒體通透性抑制劑CsA預處理，細胞的紅色熒光明顯變弱，其熒光強度與對照組細胞幾乎相同，可見CsA有效阻斷了PA所致的細胞凋亡。

Fig 3 Influence of PA(0.4 mmol·L-1)on expression of mitochondrial apoptosis pathway protein in HUVECs n=3)

*P<0.05vs0 h group

Fig 4 Effects of PA(0.4 mmol·L-1) on apoptosis of HUVECs (scale bar: 50 μm)

TUNEL is red fluorescence. Fluorescence images of HUVECs stained with TUNEL after cells were incubated for 0 h (A), 12 h (B), 24 h (C) and 48 h (D) with 0.4 mmol·L-1PA.

Fig 5 Influence of mitochondrial apoptosis pathway inhibitor CsA on apoptosis of HUVECs exposed to PA (scale bar: 50 μm)

Fluorescence images of HUVECs stained with TUNEL after cells were incubated for 24 h with control (A), 0.4 mmol·L-1PA (B) and 0.4 mmol·L-1PA+10 μmol·L-1CsA (C).

3 討論

動脈粥樣硬化的發生、發展機制錯綜復雜，其原因可以歸因于部分環境因素和部分先天性因素。這些環境因素和先天性因素雖然不能被認定為動脈粥樣硬化的絕對病因，但在某種程度上可以歸結為誘發動脈粥樣硬化的高風險因素，其防治在臨床也越來越得到重視。不少文獻曾對此類高風險因素進行過研究，其中高血脂被報道為動脈粥樣硬化的關鍵危險因素之一，受到廣泛關注，除此之外，還有糖尿病、吸煙、高血壓等[7-8]。近年來，動脈粥樣硬化發病機制的相關研究取得了一些成果，闡明了脂毒性內皮損傷導致動脈粥樣硬化的部分機制，但其機制錯綜復雜，尚不清楚其具體的深入機制。基于此，本研究擬通過PA所致血管內皮細胞損傷模型，探討高脂所致血管內皮細胞損傷的機制。本研究中，當PA刺激HUVECs，細胞存活率明顯降低，證實了脂毒性損傷對內皮細胞增殖功能的影響，符合文獻報道。

內皮細胞凋亡是動脈粥樣硬化的起始階段[9-11]，研究表明，ROS和鈣離子是誘導凋亡的兩個重要因素[12-13]。ROS的產生及脂質過氧化導致鈣離子從線粒體釋放，過多的細胞內鈣離子也會導致ROS形成增加，也引起了線粒體膜電位崩潰、ATP衰竭，從而促進凋亡。研究表明，脂毒性刺激可以抑制血管內皮細胞Bcl-2蛋白的表達[14]。而Bcl-2大多定位于線粒體外膜上，調節線粒體外膜通透性，具有抑制凋亡的作用[15]。Bax是與Bcl-2共沉淀的一種蛋白質，促進細胞凋亡[15]。高脂刺激時，細胞內會產生大量的ROS，而ROS的產生會影響Bcl-2和Bax的表達，進而影響線粒體通透性，外膜孔徑變大，變大的線粒體孔徑導致線粒體中Cyt-C的釋放以及AIF的大量表達，進而促進線粒體釋放更多的Cyt-C，而被激活的caspase又促進AIF的釋放，繼而引起caspase級聯反應中具有代表意義的cleaved caspase-3蛋白的表達，從而激活后續的細胞凋亡信號。可見，ROS誘導的線粒體凋亡機制可能參與了脂毒性內皮細胞凋亡的發病機制。本研究提示，PA刺激24 h時，HUVECs內ROS水平明顯升高，此現象說明血管內皮細胞可在高脂的刺激下出現明顯的氧化應激損傷。另一組實驗說明，PA刺激HUVECs 24 h后，線粒體促凋亡通路蛋白AIF、Cyt-C、cleaved caspase-3、Bax的表達明顯升高，線粒體抗凋亡通路蛋白Bcl-2的表達明顯降低，Bax/Bcl-2的比值明顯升高，以上結果提示氧化應激有可能通過激活線粒體凋亡通路，從而引起心肌細胞的損傷。本研究中，當用線粒體通透性抑制劑CsA預處理時，PA所致的HUVECs凋亡明顯減少，提示阻斷線粒體凋亡通路可以明顯減輕高脂刺激對血管內皮細胞的損傷，也進一步證實了脂毒性血管內皮細胞的損傷與線粒體凋亡通路的相關性。

綜上所述，PA對血管內皮細胞的脂毒性損傷，可通過氧化應激-線粒體凋亡通路的激活，使細胞出現明顯的凋亡現象，當阻斷線粒體凋亡通路時，血管內皮細胞的脂毒性凋亡被明顯緩解。總之，線粒體凋亡通路的調控對高脂所致的血管內皮細胞損傷的防治有指導意義。

(致謝: 本文實驗主要在延邊大學基礎學院藥學分析實驗室、基礎學院藥理學實驗室、附屬醫院中心實驗室完成，由湖北科技學院醫藥研究院省重點實驗室協助完成。感謝廉麗花副教授、李晶副教授、碩士生馬偉平、金艷紅、權麗娜等對本實驗的幫助與指導。)