柚皮苷預處理通過抑制內質網應激凋亡途徑減輕心肌細胞缺氧/復氧損傷

劉 丹，潘連紅，金良友，雷登徐，易 均，張永慧

( 1. 重慶三峽醫藥高等專科學校基礎醫學部藥理學教研室；2. 重慶市抗腫瘤天然藥物工程技術研究中心；3. 重慶三峽學院外國語學院英語系專業英語教研室，重慶 404120)

溶栓治療、冠狀動脈介入和冠狀動脈旁路移植術能使缺血的心肌恢復血液灌注，縮小心肌梗死面積，降低死亡率。然而，再灌注后出現的心律失常、心肌頓抑、無復流現象、心功能不全，也在威脅著患者的生命。因此，開發安全有效的抗心肌缺血/再灌注損傷(myocardial ischemia/reperfusion injury，MI/RI)藥物，改善冠心病患者預后，仍是需要迫切解決的重要問題。

柚皮苷(naringin，Nar)是一種存在于葡萄柚、橘、橙的果皮和果肉中的二氫黃酮類化合物。有研究表明，柚皮苷通過抑制炎癥、氧化應激和NF-κB在體內外的激活，減輕糖尿病視網膜病變[1]。柚皮苷通過調節一氧化氮水平，對大鼠內臟缺血/再灌注損傷產生保護作用[2]。富含柚皮苷的川芎皮對小鼠全腦缺血/再灌注損傷有保護作用[3]。柚皮苷抑制糖尿病心肌病氧化應激和內質網應激[4]。然而，柚皮苷在MI/RI中的心臟保護機制，尤其是與內質網應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)相關的信號通路，尚不十分清楚。本研究擬建立H9c2心肌細胞缺氧/復氧(hypoxia/reoxygenation，H/R)損傷模型，通過MTT法檢測細胞存活率，TUNEL染色檢測細胞凋亡，Western blot檢測CCAAT/增強子結合蛋白同源蛋白(CCAAT/enhancer-binding protein-homologous protein，CHOP)、活化轉錄因子4(activating transcription factor 4，ATF4)、真核翻譯起始因子2α(eukaryotic translation initiation factor 2α，eIF2α)、p-eIF2α、雙鏈RNA樣內質網激酶(double-stranded RNA like endoplasmic reticulum kinase，PERK)、p-PERK蛋白表達變化，探討Nar對H9c2心肌細胞H/R損傷中內質網應激凋亡途徑的影響及其分子作用機制。

1 材料

1.1細胞株與分組H9c2心肌細胞株，購自中國科學院上海生科院細胞資源中心。細胞培養達80%～90%融合后，將H9c2心肌細胞隨機分為5組：正常對照組(C)、H/R組、Nar 10 mg·L-1組(L)、Nar 20 mg·L-1組(M)、Nar 40 mg·L-1組(H)。

1.2藥物與試劑Nar購自美國Sigma公司，批號：15015502，純度≥95%。MTT試劑盒(Sigma公司，批號：146500700)；DMEM培養基(批號：12800017)、胎牛血清(批號：10099133)，均購自美國Gibco公司；胰蛋白酶(碧云天生物技術研究所，批號：C0201)；TUNEL試劑盒(瑞士Roche公司，批號：REF 11684817910)；PERK抗體(批號：ab79483)、p-eIF2α抗體(批號：ab32157)、ATF4抗體(批號：ab23760)、CHOP抗體(批號：ab11419)，均購自Abcam公司；p-PERK抗體(Cell Signaling Technology公司，批號：3179S)；eIF2α抗體(Santa Cruz公司，批號：133132)；ECL增強化學發光檢測試劑盒 (Pierce公司，批號：34580)。

1.3儀器CL31R型低溫超速離心機、多功能酶標儀(美國Thermo公司)；IX70倒置熒光顯微鏡(日本Olympus公司)；GDS8000凝膠掃描系統(美國UVP公司)。

2 方法

2.1H/R模型的建立參照文獻[5]，C組用含10%胎牛血清的DMEM培養基，在通有95%空氣+5% CO2的37 ℃培養箱內正常培養24 h；H/R組將心肌細胞置換到無糖、無血清、缺氧的DMEM培養基中培養4 h，更換為正常培養基，然后恢復培養24 h；H/R加不同濃度Nar預處理組：分別加入柚皮苷10、20、40 mg·L-1，對心肌細胞預處理6 h，在氧氣和葡萄糖剝奪下培養4 h，然后恢復培養24 h。

2.2MTT法檢測細胞存活率將H9c2細胞培養至密度為90%左右，進行細胞計數，按實驗分組接種于96孔培養板中，每孔的細胞數為5×103個，每組設3個復孔，接種后置于37 ℃、5% CO2培養箱中分別培養24 h。分別在給藥組中加入終濃度為10、20、40 mg·L-1的柚皮苷，培養6 h后，將H/R和柚皮苷3個劑量組在無糖、無血清、缺氧的DMEM培養基中處理4 h，之后在正常條件下培養24 h。C組不作任何處理。每個實驗組分別處理后，加入5 g·L-1MTT溶液10 μL，置于37 ℃培養箱中孵育4～6 h，小心吸去上清。每孔加入150 μL DMSO以溶解細胞形成的紫色結晶，在酶標儀上測定其在490 nm處OD值，進行數據分析。細胞存活率=實驗組OD/對照組OD×100%，重復測定3次。

2.3TUNEL染色檢測細胞凋亡按TUNEL原位細胞凋亡檢測試劑盒的說明書操作。細胞爬片經多聚甲醛固定及PBS洗滌后，TUNEL法原位標記心肌凋亡細胞核。光鏡200倍下觀察，凋亡細胞核染成棕黃色，正常細胞核染成藍色。

2.4Westernblot檢測復氧處理結束后，迅速收集各組細胞，用預冷的PBS小心洗滌3遍，加入含有PMSF的細胞裂解液，置于冰上作用30 min。12 000 r·min-1離心15 min，取上清液，用BCA法測定蛋白濃度并進行蛋白定量，經聚丙烯酰胺變性凝膠電泳分離蛋白，用濕轉法將蛋白轉移到聚偏氟乙烯膜，50 mol·L-1脫脂牛奶封閉，分別加入CHOP、ATF4、p-PERK、PERK、p-eIF2α、eIF2α抗體(1 ∶2 000)，4 ℃過夜，TBST洗3次，加對應1 ∶5 000稀釋的辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫孵育2 h，TBST洗3次，使用 ECL-plus試劑盒發光，通過生化檢測系統成像并分析結果，以β-actin作為內參照，檢測目的蛋白表達情況。

3 結果

3.1柚皮苷對H/R引起的心肌細胞存活率的影響Fig 1結果顯示，與C組相比，H/R組中H9c2心肌細胞存活率明顯降低(P<0.05)；與H/R模型組相比，Nar預處理可以增加H/R損傷細胞的存活率，且Nar 40 mg·L-1組效果最好(P<0.05)。

Fig 1 Effect of Nar on survival rate of H9c2 cardiac myocytes exposed to simulated

*P<0.05vsgroup C;#P<0.05vsgroup H/R

3.2柚皮苷對H/R引起的心肌細胞凋亡的影響Fig 2結果顯示，與C組相比，H/R組心肌細胞TUNEL陽性核細胞比例明顯增加(P<0.05)；與H/R模型組相比，H/R+Nar組TUNEL陽性核細胞比率明顯降低(P<0.05)。

3.3柚皮苷對H9c2心肌細胞內質網應激分子表達的影響Fig 3的Western blot結果顯示，與C組相比，H/R組CHOP、ATF4、p-eIF2α/eIF2α、p-PERK/PERK表達水平升高(P<0.05)；與H/R組比較，柚皮苷3個劑量組可使CHOP、ATF4、p-eIF2α/eIF2α、p-PERK/PERK表達水平降低，以柚皮苷20、40 mg·L-1組效果明顯(P<0.05)。

Fig 2 Effect of Nar on apoptotic rate of H9c2 cardiac myocytes exposed to H/R(×200)

Fig 3 Effect of Nar on expression of CHOP, ATF4, p-eIF2α/eIF2α and p-PERK/PERK of H9c2 cardiac myocytes exposed to

*P<0.05vsgroup C;#P<0.05vsgroup H/R

4 討論

柚皮苷具有抗氧化、抗凋亡、抗炎、抗癌等藥理作用。有研究表明，柚皮苷通過抑制p38 MAPK通路，保護心肌細胞免受阿霉素誘導的凋亡。體內研究表明，柚皮苷通過促進細胞凋亡，抑制卵巢腫瘤增殖[6-7]。柚皮苷能保護心肌細胞，對抗阿霉素誘導的心肌細胞損傷，降低葡萄糖調節蛋白78(glucose regulated protein 78,GRP78)的表達及活性氧的產生，其保護作用可能與抗氧化應激及內質網應激有關[8]。H9c2心肌細胞被廣泛認為是心肌系統研究的細胞模型，在體外研究H/R損傷細胞方面，已經建立了H/R誘導的H9c2細胞損傷模型[9]。因此，我們研究了柚皮苷在H/R中的作用及其可能的保護機制。本研究在H9c2心肌細胞H/R之前，用Nar預處理6 h，缺氧4 h復氧24 h后，采用MTT法檢測細胞存活率，TUNEL法檢測細胞凋亡。結果顯示，H/R處理后，H9c2心肌細胞存活率降低，凋亡明顯增加，而使用Nar后，可明顯抑制H/R誘導的H9c2心肌細胞凋亡。這些結果與柚皮苷通過Nrf2信號通路，對H/R誘導的H9c2細胞凋亡的保護作用研究結果一致[9]。提示柚皮苷通過抑制細胞凋亡，保護H9c2心肌細胞免受H/R損傷。

MI/RI常見的機制有氧化應激、Ca2+超載、細胞凋亡與自噬等。內質網應激是細胞凋亡三大途徑之一[10]，內質網應激在缺血心肌細胞凋亡中起著重要作用。雷帕霉素[11]、黃芪甲苷[12]等通過抑制內質網應激，發揮心肌保護作用，提示抑制ER應激可能是一個主要的治療靶點。為了證實柚皮苷的保護機制是否與內質網應激誘導的體外心肌細胞H/R損傷有關，本研究進一步探討了內質網應激介導的心肌細胞凋亡在柚皮苷對H/R誘導的H9c2心肌細胞損傷中的作用。結果發現，柚皮苷可逆轉H/R誘導的H9c2細胞內質網應激相關蛋白CHOP、ATF4、p-eIF2α/eIF2α、p-PERK/PERK的表達上調，抑制了內質網應激相關信號通路PERK-eIF2α-ATF4-CHOP的激活。

在MI/RI中,心肌細胞通過CHOP和caspase-12信號通路的激活，而產生細胞凋亡[13]。CHOP可引起Bcl-2蛋白家族成員失衡，進而促進細胞色素C從線粒體釋放，激活凋亡信號通路及相關的級聯反應，最終心肌細胞在內質網應激誘導下的細胞凋亡增加[14]。根據上述結果以及柚皮苷對H/R細胞凋亡的抑制作用，我們認為，柚皮苷通過抑制內質網應激，減輕H/R誘導的細胞凋亡。表明柚皮苷改善了H/R誘導的細胞毒性和凋亡，與調節內質網應激相關信號通路有關。

綜上所述，本研究結果表明，柚皮苷對H/R損傷的H9c2心肌細胞有保護作用，提示柚皮苷對H/R損傷的保護作用可能與激活PERK-eIF2α-ATF4-CHOP信號通路，進而抑制內質網應激及其介導的細胞凋亡有關。柚皮苷抑制內質網應激介導的細胞凋亡可能是一種新的心肌保護機制，可建立一種逆轉MI/RI的治療途徑。然而，本研究僅限于MI/RI的體外細胞模型，還需進一步開展體內或臨床研究來證明柚皮苷對MI/RI的心臟保護作用。

(致謝: 感謝重慶三峽醫藥高等專科學校工程中心實驗室為本課題研究提供儀器設備和技術支持。)