迷迭香酸類似物-11通過抑制ERK/MAPK通路誘導人胃癌MGC-803細胞凋亡

李婉婷，韋立群，李 清，潘曉杭，黃道航，甘嘉亮，黃俊力，唐雙意

(1. 廣西醫科大學第一附屬醫院藥學部；2. 廣西醫科大學藥學院；3. 廣西醫科大學第一附屬醫院結直腸肛門外科；4.廣西生物醫藥協同創新中心，廣西 南寧 530021)

美國癌癥協會最新統計結果顯示，2018年美國將有173萬癌癥病例和60多萬癌癥死亡病例，其中將有26 240個新增胃癌病例和10 800個胃癌死亡病例[1]。因此，胃癌是一個世界性公共衛生問題，手術和化療是胃癌的主要治療手段[2]，在降低死亡率方面一直有效，但胃癌患者的5年生存率仍然相對較低[3]。因此，找到一種新的方法來治療胃癌至關重要。當今各種新型的天然化合物，如足葉草毒素、紫杉醇、喜樹堿和長春堿，已經被分離出來，并作為癌癥治療的有效藥物，但其副作用較大[4]。迷迭香酸(rosmarinic acid，RA)是一種天然的苯酚羧酸，它是一種次生代謝物，通常被用作烹飪草藥，常見于草本植物中，如迷迭香、鼠尾草、百里香和薄荷[5]。RA具有多種藥理作用，包括抗癌、抗微生物、抗過敏、抗炎、抗氧化等[6]。基于RA的藥理作用十分廣泛，本課題組前期合成了十幾種迷迭香酸類似物(rosmarinic acid analogue，RAA)[7]。通過篩選，我們發現迷迭香酸類似物-11(rosmarinic acid analogue-11，RAA-11)的細胞抗癌作用較為突出，其分子質量為377.34，化學結構式見Fig 1。本課題擬用RAA-11作用于人胃癌MGC-803細胞，了解其對細胞增殖及凋亡的影響，并探討其可能機制，為進一步開發RAA提供理論依據。

Fig 1 Chemical structure of RAA-11

1 材料

1.1主要試劑及配制RAA-11由廣西醫科大學藥學院李清老師合成鑒定，純度≥98%(RAA-11溶于DMSO制成50 mmol·L-1儲備液，-20 ℃避光保存，實驗時用含血清RPMI 1640培養基稀釋成高、中、低終濃度分別為40、20、10 μmol·L-1)。RPMI 1640培養基購自美國Gibco公司；Hoechst 33258 染色液(即用型)購自北京索萊寶科技有限公司；南美胎牛血清購自依科賽生物科技(太倉)有限公司；Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒購自美國BD公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒(增強型)、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；ERK、p-ERK、GAPDH、Bax、Bcl-2、caspase-3兔抗人單克隆抗體，購自美國CST公司。

1.2儀器全自動酶標儀(美國伯騰儀器有限公司)；BX53熒光顯微鏡(日本奧林巴斯股份有限公司)；流式細胞儀(美國BD公司)；電泳儀、半干轉印槽(美國Bio-Rad公司)；LI-COR Odyssey紅外熒光掃描成像系統(美國LI-COR公司)。

2 方法

2.1細胞培養人胃癌細胞株MGC-803購自中國科學院上海細胞庫(由廣西醫科大學第一附屬醫院胃腸外科肖強課題組贈予)，于含5% CO2的37 ℃恒溫培養箱中，用含10%胎牛血清和1%青鏈霉素的RPMI 1640培養基常規培養，隔天更換培養基，長滿后，用0.25%胰酶消化傳代、凍存。

2.2MTT法常規培養人胃癌MGC-803細胞，待處于對數生長期時進行消化，接種于96孔板，每孔100 μL，約5 000個/孔。貼壁后棄培養液，加入200 μL用RPMI 1640培養液稀釋的終濃度分別為0、10、20、40、80、160 μmol·L-1的RAA-11，每個劑量組設5個復孔。分別培養24、36、48 h后，加入20 μL MTT，置37 ℃恒溫箱孵育4 h后，每孔加100 μL DMSO劇烈震蕩10 min，酶標儀上490 nm波長處測定各孔的吸光度值(OD)，細胞存活率=OD加藥組/OD對照組×100%。

2.3集落形成法取對數生長期的人胃癌MGC-803細胞進行消化，用完全培養基將細胞密度調整為1×106·L-1，充分吹打成單細胞懸液后置于6孔板中，每孔500 μL。貼壁后，每孔分別加入2 mL用RPMI 1640培養液稀釋的終濃度為0、10、20、40 μmol·L-1的RAA-11，作用48 h后吸棄含藥培養基，隔天更換完全培養基，讓其生長2周(肉眼可見集落為準)，結束培養。PBS洗2次，室溫晾干后，用多聚甲醛固定15 min。棄多聚甲醛晾干，0.1%結晶紫染色20 min后，在倒置顯微鏡下拍照，集落抑制率=(集落數對照組-集落數加藥組)/集落數對照組×100%。

2.4Hoechst33258染色法取對數生長期的人胃癌MGC-803細胞進行消化，用完全培養基將細胞密度調整為2×107·L-1，接種到內嵌有無菌處理的蓋玻片6孔板中，每孔2 mL。貼壁后，每孔分別加入2 mL用RPMI 1640培養液稀釋的終濃度為0、10、20、40 μmol·L-1的RAA-11。作用48 h后，每孔加入1 mL 4%多聚甲醛，室溫固定20 min，每孔用0.5 mL Hoechst 33258室溫避光染色15 min，棄染色液，用PBS輕輕漂洗2遍。小心輕取蓋玻片，放在干凈載玻片上，加1滴抗熒光淬滅封片液(甘油 ∶PBS=1 ∶9)封片，于顯微鏡觀察。

2.5流式細胞術取對數生長期的人胃癌MGC-803細胞進行消化，用完全培養基將細胞密度調整為1.5×108·L-1，接種到6孔板，每孔2 mL。貼壁后，每孔分別加入2 mL用RPMI 1640培養液稀釋的終濃度為0、10、20、40 μmol·L-1的RAA-11。作用48 h后收集細胞上清液，用胰酶消化貼壁細胞，將上清液和消化下的細胞1 000×g離心5 min。棄上清，加1 mL冰PBS重懸，1 000×g離心5 min，重復2次。棄PBS，加200 μL 1×Binding Buffer重懸后，加入5 μL PI和5 μL Annexin V，室溫避光孵育15 min，再加入300 μL 1×Binding Buffer，300目濾網過濾1次，于1 h內上機。

2.6Westernblot取對數生長期的人胃癌MGC-803細胞進行消化，接種于25 cm2培養瓶中，待其長到80%～90%左右，每瓶分別加入3 mL用RPMI 1640培養液稀釋的終濃度為0、10、20、40 μmol·L-1的RAA-11。作用48 h后，收集細胞上清液并消化細胞，PBS緩沖液洗3次后，加裂解液(RIPA ∶PMSF ∶Cocktail=100 ∶1 ∶1)冰上裂解20 min，4 ℃、12 000 r·min-1離心20 min。BCA法檢測蛋白濃度后，上清液加上樣蛋白緩沖液煮沸變性5 min。取40 μg蛋白樣品先60 V恒壓電泳，待樣品電泳至分離膠后，將電壓換成120 V電泳至膠底部。半干轉印槽將蛋白轉移至PVDF膜上，TBST洗膜3次，用5% BSA室溫封閉30 min，一抗冰上孵育過夜。二抗室溫避光孵育1 h，TBST避光洗膜3次后，用Odyssey紅外熒光掃描成像系統掃描顯影。

3 結果

3.1RAA-11對細胞增殖的抑制作用Tab 1結果顯示，RAA-11對MGC-803細胞的增殖有明顯抑制作用，并存在濃度依賴性和時間依賴性。線性回歸結果得出RAA-11作用MGC-803細胞24、36、48 h的IC50分別是72.781、59.979、40.625 μmol·L-1。RAA-11作用MGC-803細胞48 h后，其濃度變化對細胞增殖的抑制作用較為突出，故選擇RAA-11作用MGC-803細胞48 h進行后續實驗。

Tab 1 Influence of RAA-11 on survival rate of human gastric cancer MGC-803 cells at different concentrations at different

**P<0.01vs0 μmol·L-1group

3.2RAA-11對細胞集落形成的抑制作用如Fig 2所示，與對照組比較，不同濃度RAA-11作用胃癌MGC-803細胞48 h后，MGC-803細胞的克隆抑制率隨著藥物濃度升高而升高，RAA-11濃度0、10、20、40 μmol·L-1的克隆抑制率分別為15.8%、62.8%、81.4%、88.6%。抑制效果具濃度依賴性，與MTT法共同說明RAA-11可以有效抑制胃癌MGC-803細胞的增殖。

3.3RAA-11對細胞凋亡形態學的影響如Fig 3所示，與對照組比較，RAA-11作用MGC-803細胞48 h后，細胞出現明顯的凋亡特征，在熒光顯微鏡下呈強熒光反應，隨著藥物濃度增加，細胞凋亡率明顯上升。結果提示RAA-11對MGC-803細胞有一定的促凋亡作用。

3.4RAA-11對細胞凋亡的影響如Fig 4所示，RAA-11(0、10、20、40 μmol·L-1)作用于MGC-803細胞48 h后，細胞凋亡率明顯升高。結果表明，RAA-11能夠引起MGC-803細胞的凋亡，且呈劑量依賴關系。

3.5RAA-11對細胞凋亡相關蛋白的影響Fig 5的Western blot結果顯示，RAA-11作用于MGC-803細胞48 h后，與對照組比較，抑凋亡蛋白Bcl-2表達降低，促凋亡蛋白Bax和caspase-3表達增加，提示RAA-11可誘導MGC-803細胞的凋亡。

3.6RAA-11對細胞通路蛋白的影響如Fig 6所示，RAA-11作用于MGC-803細胞48 h后，與對照組比較，通路蛋白ERK、p-ERK表達明顯下調，提示RAA-11可能通過抑制MAPK-ERK通路來誘導MGC-803細胞凋亡。

Fig 3 Influence of different concentrations of RAA-11 on nucleus apoptotic morphology and apoptotic rate of human gastric cancer MGC-803 cells(×200)

4 討論

RA是一種含多酚羥基的化合物，化學名稱為R(t)2-[[3-(3，4-二羥基苯基)-1-氧代-2-丙烯基]氧基]-3，4-二羥基苯丙酸，由一分子咖啡酸和一分子3，4-二羥基苯基乳酸縮合而成[8]，其成分主要為二萜酚類、黃酮類、三萜類、精油等。RA具有較好的水溶性和穩定性，且具有抗氧化、抗菌、美容、抗腫瘤、消炎、抗心血管疾病等諸多作用[9]，近年來，其抗腫瘤效果頗受關注。RA植物來源豐富，可通過多種途徑發揮抗腫瘤作用[10]，作為抗腫瘤藥物具有良好的應用前景。

細胞凋亡是最常見的細胞生理性死亡形式(即非病理性細胞死亡)，可發生于胚胎發育、組織重建、免疫調節及腫瘤退化的各個時期[11]。caspase-3

A:RAA-11 0 μmol·L-1; B: RAA-11 10 μmol·L-1;C:RAA-11 20 μmol·L-1;D:RAA-11 40 μmol·L-1; E:Histogram of cell apoptosis rate.**P<0.01vs0 μmol·L-1group.

是一種含有277個氨基酸殘基的蛋白酶，分子質量約32 ku，是caspase家族在細胞凋亡過程中最主要的終末剪切酶之一。其下游因子Bcl-2是一種癌基因，它具有抑制凋亡的作用，目前已經發現的Bcl-2蛋白家族按功能可分為兩類：一類是像Bcl-2一樣具有抑制凋亡作用，如Bcl-xL、Bcl-w、Mcl-1、A1等;而另一類具有促進凋亡作用，如Bax、Bcl-xS、Bik/Nbk、Bid等[12]。我們的研究顯示，RAA-11能夠促進凋亡啟動因子caspase-3和促凋亡因子Bax的表達，抑制抑凋亡因子Bcl-2的表達，提示RAA-11能夠誘導人胃癌MGC-803細胞的凋亡。

ERK是一類絲/蘇氨酸蛋白激酶，是傳遞絲裂原信號的信號轉導蛋白[13]。它正常定位于胞質，當激活后轉位至胞核，調節轉錄因子活性，產生細胞效應。已知ERK家族有5個亞族，包括ERK1～ERK5，其中ERK1和ERK2途徑是ERK家族中研究最徹底的[14]。ERK調節著細胞的增殖、分化和存活，是多種生長因子(EGF、NGF、PDGF等)的下游蛋白。ERK及其信號途徑在腫瘤侵襲和轉移過程中起中介和放大信號的作用：一方面，接受大量來自生長因子、絲裂原、環境刺激等的信號；另一方面，通過ERK信號級聯反應作用于核轉錄因子，如AP-1、NF-κB等，調控基因表達。在許多人類的癌癥(如口腔癌、黑色素瘤、乳腺癌等)中都可發現ERK的過度激活[15]。本研究顯示，RAA-11明顯下調了通路蛋白ERK、p-ERK的表達量，我們猜想RAA-11可能通過抑制ERK/MAPK通路，抑制人胃癌MGC-803細胞增殖并誘導其凋亡。

Fig 5 Influence of different concentrations of RAA-11 on apoptosis related protein expressions in human gastric cancer MGC-803

**P<0.01vs0 μmol·L-1group

Fig 6 Influence of different concentrations of RAA-11 on ERK pathway protein expressions in human gastric cancer MGC-803

**P<0.01vs0 μmol·L-1group

綜上所述，本研究顯示，RAA-11能夠有效抑制人胃癌MGC-803細胞的增殖，并誘導其凋亡。然而，RAA-11這些效應的確切機制仍不清楚。我們的初步研究結果表明，RAA-11誘導MGC-803細胞凋亡可能與其抑制ERK/MAPK通路有關，為RAA-11的開發與應用奠定了科學的理論基礎。