小分子阿膠抗疲勞、抗氧化及止血作用研究

姜一樸，邸志權(quán)，王延濤，安夢培，胡金芳，金 涌，張宗鵬，張 淹

(1. 安徽醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，安徽 合肥 230032；2. 天津藥物研究院新藥評價有限公司，天津 300301；3. 東阿阿膠股份有限公司國家膠類中藥工程技術(shù)研究中心，山東 聊城 252201)

阿膠(AsiniCoriiColla)是由馬科動物驢的干燥皮或鮮皮經(jīng)煎煮、濃縮制成的固體膠，具有滋陰潤肺、補(bǔ)血止血等功效，與人參、鹿茸并稱為“中藥三寶”[1]。其成分中蛋白質(zhì)含量較高(約80%)，相對分子質(zhì)量集中在6×103～2×105u，現(xiàn)代研究表明，相對分子質(zhì)量過大會影響吸收入體或生物利用度較低，這一定程度上印證了阿膠“滋膩礙胃”的特性[2-3]。據(jù)研究，將大分子阿膠經(jīng)仿生酶解或者仿生消化得到小分子低聚肽，其具有提高免疫力的作用，并有明顯的補(bǔ)血升白作用[2,4-5]。小分子阿膠為阿膠水解物，分子量的減小使得其服用后更易被機(jī)體吸收利用，避免了因分子量大而影響藥效發(fā)揮的弊端。本研究參考阿膠的藥理作用，旨在探究小分子阿膠的抗疲勞、抗氧化及止血作用，為其工藝改進(jìn)提供一定的理論依據(jù)。

1 材料

1.1實驗動物ICR小鼠，SPF級，♂ ♀各半，體質(zhì)量(19±1)g；SD大鼠，SPF級，♂ ♀各半，體質(zhì)量(170±10)g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK(京)2016-0006。

1.2儀器ADVIA2120型血液分析儀(Siemens Healthcare Diagnostics Inc.)；ACL9000型凝血分析儀(Instrumentation Laboratory Co.)；SHHW21/600A Ⅱ型三用電熱恒溫水箱(天津市泰斯特儀器有限公司)；ST 16R型離心機(jī)(Thermo Fisher Scientific Inc.)。

1.3藥品與試劑小分子阿膠(small moleculeAsiniCoriiColla，SMACC)：批號1609001，東阿阿膠股份有限公司；生血丸：批號9880013，天津中新藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司達(dá)仁堂制藥廠；乙酰苯肼(acetyl phenylhydrazine，APH)：批號20161104，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide，CTX)：批號16031225，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司；安琪高活性干酵母：生產(chǎn)日期20160810，安琪酵母股份有限公司；肝素鈣注射液：批號55151202，天津生物化學(xué)制藥有限公司；丙二醛(maleic dialdehyde，MDA，批號20161227)、脂質(zhì)過氧化物(lipid peroxide，LPO，批號20161227)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD，批號20170118)試劑盒，均購自南京建成生物工程研究所；血液學(xué)檢測試劑：SIEMENS ADVIA三合一正常值質(zhì)控全血(批號72025)、全血細(xì)胞計數(shù)配套試劑(批號45688)、白細(xì)胞分類計數(shù)配套試劑(批號54747)，購自SIEMENS公司；凝血功能檢測試劑：質(zhì)控血漿(批號N0942249)、凝血酶原時間(prothrombin time，PT，批號N0696900)、凝血酶時間(thrombin time，TT，批號N0556567)、活化部分凝血活酶時間(activated partial thromboplastin time，APTT，批號N1058925)、纖維蛋白原(fibrinogen，F(xiàn)IB，批號N0656757)，購自美國實驗室儀器公司。

2 方法

2.1劑量設(shè)定參考阿膠的用法用量(人的日用量按9 g計)，人體質(zhì)量按60 kg計，小鼠體質(zhì)量按20 g計，依體表面積換算成小鼠的等效劑量為1.70 g·kg-1，依此進(jìn)行預(yù)實驗后，本研究將小分子阿膠的小鼠劑量設(shè)置為3.00、1.50、0.75 g·kg-1，大鼠劑量設(shè)置為1.500、0.750、0.375 g·kg-1。

2.2實驗動物分組及給藥動物隨機(jī)分為6組，分別為對照組、模型組、陽性藥組(生血丸：大鼠1.500 g·kg-1; 小鼠3.00 g·kg-1)、小分子阿膠高、中、低劑量組。采用灌胃法，各組按大鼠10 mL·kg-1，小鼠20 mL·kg-1每天給藥1次，對照及模型組給予等量去離子水，連續(xù)14 d。

2.3對復(fù)合血虛模型大鼠的影響參考文獻(xiàn)[6]方法，選用SD大鼠，于給藥d 8，除對照大鼠外，腹腔注射APH 30 mg·kg-1；于d 12，腹腔注射APH 60 mg·kg-1、CTX 100 mg·kg-1，給藥結(jié)束于d 15，將大鼠放入冰水中游泳計時，記錄大鼠的力竭時間(上下沉浮多次為限)，隨后麻醉大鼠，腹主動脈采集EDTA抗凝血用于血液學(xué)檢查，采集促凝血，離心獲得血清，檢測SOD、MDA、LPO。

2.4對小鼠出血、凝血時間的影響選用ICR小鼠(無模型組)，于d 14給藥1 h后，毛細(xì)管法測定凝血時間(clotting time，CT)，剪尾法測定出血時間(bleeding time，BT)。計算改善率：改善率=(給藥組時間-對照組時間)/對照組時間×100%。

2.5對血熱復(fù)合出血模型大鼠的影響參考文獻(xiàn)[7]方法，選用SD大鼠，于給藥d 14，除對照大鼠外，皮下注射質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%的酵母混懸液10 mL·kg-1，5 h后灌胃給藥，1 h后灌胃給予1 mL無水乙醇，給藥結(jié)束于d 15麻醉大鼠，腹主動脈采血，檢測血漿TT、APTT、PT、FIB，并進(jìn)行血液學(xué)檢查。

2.6對肝素化出血模型大鼠的影響參考文獻(xiàn)[8]方法，選用SD大鼠，d 14末次給藥后，皮下注射肝素鈣300 U·kg-1復(fù)制出血模型，1 h后麻醉大鼠，腹主動脈采血，檢測血漿TT、APTT、PT、FIB。

3 結(jié)果

3.1SMACC對復(fù)合血虛模型大鼠的影響與對照組比較，模型大鼠體質(zhì)量明顯下降(P<0.05)，游泳力竭時間明顯縮短(P<0.01)，血清中抗氧化成分SOD活性明顯降低(P<0.01)，氧化產(chǎn)物MDA、LPO含量明顯升高(P<0.01)，白細(xì)胞(white blood cell，WBC)計數(shù)、淋巴細(xì)胞(lymphocyte，LYM)數(shù)量、紅細(xì)胞(red blood cell，RBC)計數(shù)、血紅蛋白(hemoglobin，HGB)濃度、紅細(xì)胞比容(hematocritg，HCT)均明顯降低(P<0.01)。相比于模型組，小分子阿膠1.500、0.750、0.375 g·kg-1有效延長大鼠游泳力竭時間(P<0.05，P<0.01)，降低血清中MDA、LPO含量(P<0.05，P<0.01)，1.500、0.375 g·kg-1劑量組LYM數(shù)量明顯增加(P<0.05)。見Fig 1、2，Tab 1。

Fig 1 Effect of SMACC on body weight and exhausted timein rats with complex blood

*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05，##P<0.01vsmodel

Fig 2 Effect of SMACC on serum SOD，MDA and LPO in rats

**P<0.01vscontrol;#P<0.05，##P<0.01vsmodel

Tab 1 Effect of SMACC on hematological indicators in rats with complex blood

**P<0.01vscontrol;#P<0.05vsmodel

Tab 2 Effect of SMACC on coagulative function in fevered and bleeding

**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsmodel

Tab 3 Effect of SMACC on hematological indicators in fevered and bleeding

*P<0.05，**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsmodel

3.2SMACC對小鼠出血、凝血時間的影響如Fig 3所示，相比于對照組，小分子阿膠3.00、1.50 g·kg-1明顯縮短CT、BT，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

Fig 3 Effect of SMACC on clotting time and bleeding time

*P<0.05vscontrol

3.3SMACC對血熱復(fù)合出血模型大鼠的影響Tab 2、3結(jié)果顯示，與對照組相比，模型大鼠PT、APTT明顯延長(P<0.01)，TT縮短(P<0.01)，F(xiàn)IB水平明顯增加(P<0.01)，WBC、LYM、血小板(blood platelet，PLT)數(shù)量明顯降低(P<0.01)。與模型組比較，小分子阿膠1.500 g·kg-1對PT具有明顯縮短作用(P<0.05)，增加FIB水平(P<0.01)；1.500、0.750 g·kg-1劑量組WBC、LYM、RBC、HGB、HCT均明顯升高(P<0.01，P<0.05)，1.500、0.375 g·kg-1劑量組PLT升高(P<0.01)。

3.4SMACC對肝素化出血模型大鼠的影響對照組大鼠PT、APTT、TT均明顯延長，其中TT、APTT、FIB超過儀器檢測限值。與對照組比較，小分子阿膠各劑量組對APTT、TT、FIB無明顯影響，仍在儀器檢測限值之外，結(jié)果不做統(tǒng)計。小分子阿膠1.500 g·kg-1明顯縮短PT(P<0.01)，見Fig 4。

4 討論

APH具有強(qiáng)氧化作用，通過干擾RBC內(nèi)的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶，引起RBC破壞、HGB減少等溶血性貧血。CTX是一種細(xì)胞毒制劑，也是一種免疫抑制劑，不僅對機(jī)體的免疫器官有損傷作用，也對增殖周期中各期細(xì)胞具有殺滅作用，使骨髓造血功能抑制，從而使動物表現(xiàn)出血虛證狀。APH與CTX聯(lián)合，經(jīng)兩個途徑共同造成動物血虛，使各類細(xì)胞數(shù)量全面下降，免疫器官受到損傷[9-10]。血虛狀態(tài)下供血不足或血液的濡養(yǎng)功能減退，表現(xiàn)為全身虛弱證候，由于缺血缺氧降低了機(jī)體的新陳代謝，能量減少，因此顯示出大鼠游泳時間縮短、體溫下降等一系列氣虛狀態(tài)[11]。氧自由基增多是機(jī)體疲勞主要表現(xiàn)之一，血虛大鼠進(jìn)行游泳實驗時，機(jī)體內(nèi)一系列氧自由基代謝會發(fā)生改變，表現(xiàn)為抗氧化能力的下降和脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的增強(qiáng)[12]。SOD是機(jī)體清除氧自由基的重要酶，MDA、LPO是自由基引起的脂質(zhì)過氧化的主要產(chǎn)物，它們的活性和含量間接反映機(jī)體的抗氧化能力，同時，也能間接反映機(jī)體的疲勞狀態(tài)。

Fig 4 Effect of SMACC on coagulative functionin heparinized bleeding

**P<0.01vscontrol

血虛大鼠游泳體力耗竭時間的明顯延長，血清中氧化產(chǎn)物MDA、LPO含量的明顯降低，表明小分子阿膠能夠增強(qiáng)大鼠耐力，具有抗疲勞及抗氧化的能力。血中LYM數(shù)量呈現(xiàn)明顯增加，考慮小分子阿膠作用機(jī)制可能是通過清除自由基，保護(hù)細(xì)胞膜或加快抗氧化物合成代謝的方式，來提高機(jī)體應(yīng)對氧化應(yīng)激狀態(tài)的能力，提高機(jī)體免疫力，增強(qiáng)大鼠對APH和CTX毒性的抵抗能力，發(fā)揮抗氧化及抗疲勞作用。

小鼠斷尾出血時間(BT)和毛細(xì)管凝血時間(CT)實驗廣泛用于中藥止血、促凝血的活性篩選，綜合反映參與止血過程的血管、血小板、凝血系統(tǒng)等多種因素的功能[13]。本研究中，給藥小鼠BT、CT明顯縮短，表明小分子阿膠能夠促進(jìn)血液凝固、加快傷口的止血速度，對外傷所致的出血情況具有較好的止血功效。

血液凝固是一個多系統(tǒng)參與的復(fù)雜過程，是由一系列凝血因子參與的酶促過程，包括內(nèi)源性、外源性凝血途徑及纖溶系統(tǒng)。PT是外源性凝血途徑的常用實驗指標(biāo)，反映了外源性凝血系統(tǒng)各因子的活性及是否正常；APTT主要反映內(nèi)源性凝血因子的活性和含量的變化；TT反映的是內(nèi)、外源性共同凝血系統(tǒng)；FIB主要反映是否有足夠的纖維蛋白原來生成纖維蛋白；PLT在血液凝固過程中發(fā)揮著重要作用，它的黏附、聚集、釋放起到止血作用，同時它還為各種凝血酶原的活化提供必需的磷脂膜[14]。本研究酵母致血熱出血模型以及肝素化出血模型中，均僅見小分子阿膠對PT有明顯影響，結(jié)果一致，相互印證，提示小分子阿膠的止血作用機(jī)制可能在凝血級聯(lián)反應(yīng)上游，僅對外源性凝血途徑具有激活作用，其作用靶點可能在凝血因子Ⅲ的激活過程。另外，小分子阿膠也通過增加FIB含量，促進(jìn)纖維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維蛋白的過程，升高大鼠血中PLT數(shù)量，影響抗凝和纖溶系統(tǒng)起作用。

干酵母誘導(dǎo)血熱復(fù)合出血模型中，觀察到RBC、HGB水平明顯升高，雖未見模型組指標(biāo)有明顯異常，但仍說明在某些機(jī)制下，小分子阿膠具有“升紅”作用，推測耗氧量增加可能是模型形成的機(jī)制之一，小分子阿膠具有抗氧化的作用，從而提高了RBC、HGB水平。小分子阿膠逆轉(zhuǎn)WBC、LYM等血液學(xué)指標(biāo)的不良改變，提示其可能具有一定的“升白”作用，其具體“升紅”“升白”作用及機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。

綜上研究結(jié)果表明，小分子阿膠具有抗疲勞、抗氧化、增加耐力的作用，同時具有止血收斂的作用，將阿膠水解制得小分子阿膠的工藝改進(jìn)具有可行性。

(致謝: 本實驗于天津藥物研究院新藥評價有限公司實驗室完成，在此對本實驗做出貢獻(xiàn)的所有人員給予誠摯的感謝。)