lncRNA uc.48+對2型糖尿病大鼠肝糖原的影響

余克花，李 琳，王夢珂，劉雙梅，梁尚棟

(南昌大學(xué)1. 醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心、2. 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，江西 南昌 330006)

糖尿病(diabetes mellitus，DM) 是一組代謝性臨床綜合征，隨著社會(huì)的發(fā)展和人們生活水平的提高，糖尿病的患病率逐年升高。在發(fā)達(dá)國家，糖尿病患病率已達(dá)3%～7%，成為僅次于癌癥、艾滋病、心腦血管病之后第4 位需要優(yōu)先考慮的疾病，已成為世界第5 位死亡主因[1-4]。我國糖尿病人群的構(gòu)成，以2型糖尿病為主，占糖尿病人群的90%以上，嚴(yán)重影響著人民健康和社會(huì)發(fā)展[1,3,5-6]。2型糖尿病最主要的癥狀是高血糖，高血糖是引發(fā)糖尿病并發(fā)癥的主要原因，據(jù)估計(jì)，全球6個(gè)人里面就有1個(gè)人處于患糖尿病并發(fā)癥的危險(xiǎn)中[1-6]。

葡萄糖激酶(glucokinase，GK)是己糖激酶家族中的一員，分子質(zhì)量為52 ku，由448個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成[5,7]。肝臟GK參與葡萄糖磷酸化，加速糖原合成及葡萄糖代謝。GK是糖代謝途徑中的關(guān)鍵酶，特異性地存在于胰腺β細(xì)胞和肝細(xì)胞，可促進(jìn)胰島素分泌和葡萄糖代謝，參與糖代謝的各條途徑[5,7-8]。肝臟中的GK是糖酵解過程中第一步的限速酶，催化葡萄糖磷酸化生成6-磷酸葡萄糖，后者在胰島素作用下，經(jīng)過糖原合成途徑合成肝糖原儲(chǔ)存起來。因此，肝臟中的GK的主要作用是促進(jìn)糖酵解，加速糖原合成和抑制糖異生，調(diào)節(jié)肝細(xì)胞對葡萄糖的攝取與利用，從而有效控制體內(nèi)血糖平衡[5,8]。

非編碼RNA(noncoding RNA, ncRNA)是一類不編碼蛋白質(zhì)，但具有生物學(xué)調(diào)控功能的RNA分子，同時(shí)與一些重要疾病的病理生理過程相關(guān)[3,9-10]。長度大于200個(gè)堿基(200 nt)為長鏈非編碼RNA (long noncoding RNA, lncRNA)。本項(xiàng)目前期用SOLiD高通量測序，并通過生物信息學(xué)預(yù)測和分子生物學(xué)驗(yàn)證，確定大鼠肝臟存在lncRNA uc.48+ (http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgc?hgsid=427967671_gIIKDUiyguaFXCbRBiWSM7gFO gqn&c=chr2&o=20462844&t=20463142&g=ct_Ultra_7128&i=%28null%29+uc.48)[9], 并發(fā)現(xiàn)糖尿病模型大鼠肝臟lncRNAuc.48+表達(dá)較對照組明顯增加，提示肝臟的lncRNAuc.48+與糖尿病的病理變化有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用2型糖尿病模型大鼠，觀察lncRNAuc.48+小干擾RNA對2型糖尿病模型大鼠血糖的影響及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組Sprague-Dawley(SD)♂大鼠，40只，清潔級(jí)，體質(zhì)量200 g左右，購于南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(贛)2015-0001。大鼠分籠飼養(yǎng)，每籠飼養(yǎng)7只，溫度20～25 ℃，相對濕度40%～70%，晝夜明暗交替12 h/12 h,自由飲水。適應(yīng)1周后，禁食不禁水12 h，剪尾采血測血糖。將大鼠隨機(jī)分成對照組(Control)和模型組，對照組始終喂養(yǎng)普通飼料(由南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部提供)，模型組喂養(yǎng)高糖高脂飼料(基礎(chǔ)飼料66.5%、蔗糖20%、豬油10%、膽固醇2.5%、膽酸鈉1%，加水做成條狀，放在恒溫鼓風(fēng)干燥箱中80 ℃干烤3 h)。第5周末(即模型組喂高糖高脂飼料4周后)，所有大鼠禁食不禁水12 h測血糖。模型組大鼠空腹腹腔注射鏈脲佐菌素(streptozotocin, STZ)30 mg·kg-1(臨用前將STZ溶解于4 ℃冰箱預(yù)冷的pH為4.2的0.1 mol·L-1檸檬酸鈉-檸檬酸緩沖液中，配制成2.5 g·L-1的STZ溶液)。第6周末，空腹血糖小于7.8 mmol·L-1的大鼠再注射STZ 30 mg·kg-1一次，第7周末，測空腹血糖大于7.8 mmol·L-1為成模標(biāo)準(zhǔn)。

lncRNAuc.48+小干擾RNA(siRNA)序列由Invitrogen公司提供，靶序列為5′-GGCACTACTACTTGCAGAA-3′；陰性對照scrambled siRNA (NC siRNA)購自Invitrogen公司。在體轉(zhuǎn)染試劑由EntransterTM公司提供。根據(jù)EntransterTM在體轉(zhuǎn)染說明書，實(shí)驗(yàn)第10周末，對糖尿病造模成功的大鼠進(jìn)行l(wèi)ncRNAuc.48+siRNA在體小干擾實(shí)驗(yàn)。成模后的大鼠再隨機(jī)分成：糖尿病模型+生理鹽水對照組、糖尿病模型+lncRNAuc.48+siRNA處理組、糖尿病模型+NC siRNA處理組。糖尿病模型小干擾RNA處理組的大鼠分別通過尾靜脈注射lncRNAuc.48+小干擾RNA或scrambled siRNA。對照組和糖尿病模型組均尾靜脈注射相同體積生理鹽水。1周后，取各組大鼠標(biāo)本檢測相關(guān)指標(biāo)。

1.2試劑GK抗體(Abcam公司)；p-Akt1與Akt1抗體，購自以色列Alomone Labs，Jerusalem公司；肝/肌糖原試劑盒(南京建成生物工程研究所)；β-actin一抗、羊抗鼠二抗、羊抗兔二抗(中杉金橋)；GK及β-actin引物(南京金斯瑞生物科技有限公司)；BCA蛋白定量試劑盒(凱基生物)。

1.3儀器羅康全活力型血糖儀(德國羅氏公司)；ABI7500實(shí)時(shí)定量PCR儀(美國ABI公司)；凝膠成像儀(Bio-Rad公司)。

1.4血糖的測定分別于第1、5、10、11周末，用血糖儀測量各組大鼠空腹血糖(禁食12 h，自由飲水)和餐后血糖，每次測量由相同人員操作，其他條件保持一致。剪尾采血方法：首先用酒精棉球擦拭大鼠尾端，然后用消毒剪刀剪去尾尖2 mm左右，將血直接滴在已準(zhǔn)備好的血糖試紙上測量。采血結(jié)束后，對大鼠尾端傷口行碘伏消毒。

1.5肝糖原含量測定取各組大鼠肝臟，用DEPC處理過的PBS清洗，具體操作按試劑盒說明書進(jìn)行，用全自動(dòng)生化儀測定。最后根據(jù)公式計(jì)算肝臟組織糖原含量: 糖原含量(mg/g 組織)=(測定管OD值-標(biāo)準(zhǔn)管OD值)×標(biāo)準(zhǔn)管含量×樣本測試前稀釋倍數(shù)×樣本測試過程中稀釋倍數(shù)÷1.11。

1.6實(shí)時(shí)定量PCR(qPCR)檢測肝臟GKmRNA表達(dá)使用TRIzol總RNA提取試劑盒(北京天根生物公司)從肝臟中提取總RNA。使用RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit(美國Fermentas公司)，按照說明書合成cDNA。使用Primer Express 3.0軟件(Applied Biosystems)設(shè)計(jì)引物， 引物序列如下：GK上游引物: 5′-GGCTTCACCTTCTCCTTCCC-3′，下游引物: 5′-CACATTGGCGGTCTTCATAG-3′，產(chǎn)物223 bp；β-actin 上游引物: 5′-TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT-3′，下游引物：5′-CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC-3′，產(chǎn)物240 bp；uc.48+ 上游引物:5′-GCAAACTGGATGAGGAT-3′ ，下游引物:5′-GTAGTGCCACAAGGAGA-3′。使用SYBR?Green Master Mix ABIPRISM?7500序列檢測系統(tǒng)(Applied Biosystems)進(jìn)行定量PCR。熱循環(huán)參數(shù)為95 ℃，持續(xù)30 s，然后在95 ℃下進(jìn)行40個(gè)循環(huán)的放大5 s，60 ℃放置30 s。通過熔解曲線確定擴(kuò)增特異性，并使用ABI7500 PCR儀器內(nèi)的軟件分析處理結(jié)果。

1.7蛋白印跡檢測肝臟GK、p-Akt1與Akt1的含量將肝臟置于勻漿器中，加入蛋白提取液(RIPA)和PMSF，于冰上進(jìn)行勻漿，提取總蛋白，按照BCA試劑盒說明書檢測蛋白濃度。獲取的蛋白按照20 μg對應(yīng)的體積加樣，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜。常溫下5%的脫脂牛奶(脫脂奶粉+TBST液)封閉2 h，分別加入一抗4 ℃孵育過夜。次日洗膜后,膜放于二抗中孵育2 h后，用TBST洗膜3次，每次10 min。凝膠成像系統(tǒng)顯影液曝光。以β-actin為內(nèi)參，凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行條帶灰度值掃描，用Image-Pro Plus圖像分析系統(tǒng)觀察分析綜合光密度。以各組β-actin條帶的綜合光密度值標(biāo)化其相應(yīng)組目的蛋白相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1糖尿病模型大鼠肝臟uc.48+的表達(dá)Fig 1的實(shí)時(shí)定量PCR檢測顯示，糖尿病模型(DM)大鼠

肝臟uc.48+的表達(dá)水平較對照組明顯增加(P<0.05)。

Tab 1 Changes of blood glucose before uc.48+siRNA

**P<0.01vscontrol group

Fig 1 Expression of lncRNA uc.48+ in

*P<0.05vscontrol group

2.2uc.48+siRNA對大鼠血糖的影響Tab 1結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)開始時(shí)(1周末)，正常組大鼠與糖尿病模型組大鼠空腹血糖(fasting blood glucose，F(xiàn)BG)和餐后血糖(postprandial blood glucose，PBG)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；到第10周末，注射STZ后，糖尿病模型組大鼠與正常對照組大鼠相比，餐后血糖和空腹血糖均升高(P<0.01)。Tab 2結(jié)果顯示，第11周末，與DM組相比，DM+uc.48+siRNA處理組空腹血糖和餐后血糖均有所降低(P<0.05)。DM組與DM+NC siRNA組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

Tab 2 Changes of blood glucose after

**P<0.01vscontrol group;#P<0.05vsDM group

2.3uc.48+siRNA對大鼠肝糖原的影響各組大鼠肝糖原檢測結(jié)果顯示(Tab 3)，DM組與對照組相比，肝糖原明顯下降(P<0.01)，DM+uc.48+siRNA組與DM組相比，肝糖原明顯升高(P<0.05)。DM組與DM+NC siRNA組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

Tab 3 Effect of uc.48+siRNA on liver

**P<0.01vscontrol group;#P<0.05vsDM group

2.4uc.48+siRNA對大鼠肝臟GKmRNA表達(dá)的影響如Fig 2所示，與正常對照組相比，糖尿病模型組肝臟中GK mRNA的表達(dá)明顯降低(P<0.01)；uc.48+小干擾RNA處理組與糖尿病模型組相比，肝臟中GK mRNA的表達(dá)明顯升高(P<0.01)。DM組與DM+NC siRNA組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

Fig 2 Expression of GK mRNA in liver

**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsDM group

2.5uc.48+siRNA對大鼠肝臟GK蛋白表達(dá)的影響如Fig 3所示，與正常對照組相比，糖尿病模型組肝臟中GK的表達(dá)明顯降低(P<0.05)；uc.48+小干擾RNA處理組與糖尿病模型組相比，肝臟中GK的表達(dá)明顯升高(P<0.01)。DM組與DM+ NC siRNA組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.6uc.48+siRNA對大鼠肝臟Akt1、p-Akt1蛋白表達(dá)的影響Fig 4結(jié)果顯示，各組間Akt1蛋白含量差異無顯著性。與正常對照組相比，糖尿病模型組肝臟中p-Akt1的表達(dá)明顯降低(P<0.01)；uc.48+小干擾RNA處理組與糖尿病模型組相比，肝臟中p-Akt1的表達(dá)明顯升高(P<0.01)。DM組與DM+NC siRNA組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

Fig 3 Expression of GK protein in

*P<0.05vscontrol group;##P<0.01vsDM group

Fig 4 Expression of Akt1 and p-Akt1 protein in

**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsDM group

3 討論

糖尿病是以高血糖、高血脂為特征的代謝紊亂綜合征[2,4]。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用高糖高脂飼料喂養(yǎng)聯(lián)合小劑量STZ注射，誘導(dǎo)建立類似2型糖尿病大鼠模型，模型組大鼠檢測餐后血糖、空腹血糖均較對照組明顯增高，達(dá)到了糖尿病的診斷標(biāo)準(zhǔn)，說明2型糖尿病建模成功。人類基因組lncRNAs有481種超保守元件，其特征為長度大于200 bp，且在不同物種之間具有超級(jí)保守性[11]。uc.48+是lncRNA[9]。本研究觀察到2型糖尿病模型大鼠肝臟的lncRNA uc.48+表達(dá)增加，提示uc.48+與2型糖尿病有關(guān)。實(shí)驗(yàn)觀察到糖尿病模型大鼠用uc.48+小干擾RNA處理后，餐后血糖、空腹血糖較模型大鼠降低，表明uc.48+小干擾RNA可降低糖尿病模型大鼠升高的血糖。

本實(shí)驗(yàn)中，糖尿病模型大鼠肝糖原檢測顯示，糖尿病模型組大鼠肝糖原較對照組明顯降低，糖尿病模型大鼠加uc.48+小干擾RNA處理后，肝糖原的合成較糖尿病模型組大鼠增多，提示uc.48+小干擾RNA可通過促進(jìn)葡萄糖代謝途徑，降低血糖。研究表明，普通糖尿病患者及糖尿病動(dòng)物模型體內(nèi)GK活性明顯降低，它可能對糖尿病的發(fā)生、發(fā)展產(chǎn)生重要影響[8]，而增加GK活性可促進(jìn)葡萄糖的磷酸化，促進(jìn)糖原合成和胰島素釋放，從而改善糖耐量異常，提高胰島細(xì)胞功能，改善糖尿病癥狀[5,7-8]。實(shí)驗(yàn)中還觀察到糖尿病模型組肝臟GK mRNA和蛋白表達(dá)較對照組明顯減少，經(jīng)uc.48+小干擾RNA干預(yù)后，肝臟GK mRNA與蛋白表達(dá)較糖尿病模型組明顯增加。血糖增高時(shí)，GK可使肝糖原合成增加，抑制肝臟糖異生，以維持血糖穩(wěn)態(tài)[5,7-8]。

Akt是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，可引起Ser/Thr磷酸化，參與肝臟組織的分化、生長，可調(diào)節(jié)胰島素介導(dǎo)的糖代謝[12]。激活的Akt可促進(jìn)肝細(xì)胞GK mRNA的表達(dá)[13]。本研究糖尿病模型大鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，激活A(yù)kt可增強(qiáng)肝臟GK的表達(dá)。研究結(jié)果提示，uc.48+小干擾RNA處理后，可增加Akt磷酸化激活，促進(jìn)GK的表達(dá)增加、肝糖原合成，進(jìn)而降低糖尿病模型大鼠升高的餐后血糖和空腹血糖。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)uc.48+小干擾RNA可降低2型糖尿病模型大鼠升高的血糖、增加肝糖原合成，其機(jī)制涉及增加GK的表達(dá)。