亞硒酸鈉通過Keap1/Nrf2/ARE信號通路誘導人肺腺癌A549細胞凋亡

田崇梅，夏道宗，邢夢雨，郭 璐，張曉熙，趙鑫鈺

(浙江中醫藥大學藥學院，浙江 杭州 310053)

肺癌發生于支氣管黏膜上皮，研究顯示，肺癌的死亡率位居我國惡性腫瘤死亡率的第1位[1]。硒(selenium，Se)是一種關鍵的營養微量元素，在人體的發病機制與穩態中扮演著重要角色[2]。本研究組在前期已經證實了亞硒酸鈉(sodium selenite)體外具有螯合鉛的作用[3]，并有研究顯示亞硒酸鈉可以誘導腫瘤細胞凋亡[4]，包括人肺腺癌A549細胞[5]、肝癌細胞[6]等，但其誘導腫瘤細胞凋亡的機制尚不明確。Kelch樣ECH相關蛋白1 (Kelch-like ECH-associated protein 1，Keap1)/核因子E2相關因子2(nuclear factor E2 related factor 2，Nrf2)/抗氧化反應元件(antioxidant response element，ARE)信號通路是重要的抗氧化應激通路，也是近十年來抗氧化研究領域的一大熱點，對這一通路的深入研究，將能夠解釋或部分解釋機體對癌癥進行自身防御抵抗的機制，此通路是肺癌治療的一個潛在靶點[7]。本研究以人肺腺癌A549細胞為研究對象，通過觀察細胞增殖、細胞凋亡、細胞形態學、抗氧化指標檢測等，研究亞硒酸鈉對人肺腺癌A549細胞的作用。初步探討亞硒酸鈉對人肺腺癌A549細胞凋亡的影響，為探索其抗肺癌作用機制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1藥物與試劑亞硒酸鈉(sodium selenite)、二甲亞砜 (DMSO)、MTT，均購自美國Sigma-Aldrich公司；RPMI 1640培養基、磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffered solution, PBS)、胰蛋白酶、青霉素-鏈霉素雙抗，購自美國Hyclone公司；胎牛血清(FBS)，購自美國BBI Life Sciences公司；Hoechst 33342試劑盒，購自碧云天生物技術公司；Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒，購自美國BD公司；活性氧(reactive oxygen species，ROS)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、還原型谷胱甘肽(glutathione，GSH)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)試劑盒，均購自南京建成試劑公司；核蛋白提取試劑盒，購自美國Thermo Scientific公司；裂解液、BCA蛋白試劑盒，購自康為世紀生物公司；Keap1、Nrf2、血紅素加氧酶1(hemeoxygenase 1，HO-1)、β-actin、Lamin B抗體，均購自美國Cell Signaling公司。

1.2人肺腺癌A549細胞的培養人肺腺癌A549細胞，購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。在37 ℃恒溫水浴箱中快速解凍A549細胞，將細胞接種于含有10% FBS的RPMI 1640完全培養基中(含100 U·L-1青霉素和100 U·L-1鏈霉素)，在37 ℃、5% CO2飽和濕度培養箱中培養細胞，2～3 d傳代1次，傳代時用胰蛋白酶消化2 min，1 ∶3傳代，取對數期生長的細胞進行實驗。

1.3細胞活力檢測取對數生長期的A549細胞(1×107·L-1)接種于96孔板中，每孔 200 μL，培養24 h，細胞長至70%～80%，吸棄孔內培養基，加入100 μL含不同濃度藥物的培養液，用RPMI 1640無血清培養液稀釋亞硒酸鈉，使其終濃度分別為2.5、5、10、15、20 μmol·L-1，空白對照組為RPMI 1640無血清培養液，每組設6個復孔。培養24 h后，各孔加入終濃度為5 g·L-1MTT液20 μL，繼續培養4 h，將原有孔中液體吸出，每孔加入150 μL DMSO，放在搖床上低速震蕩10 min，待紫色結晶物充分溶解后，置于多功能酶標儀(美國Bio-Tek公司)上，檢測波長為490 nm的吸光度值(optical density，OD)。抑制率=(1-實驗組OD/空白對照組OD)×100%。

1.4細胞形態學觀察取對數生長期的A549細胞(1×109·L-1)接種在6孔板中，分為正常組和亞硒酸鈉組(2.5、5、10 μmol·L-1)，待細胞培養24 h后，進行如下操作：① 使用倒置熒光顯微鏡(日本Olympus公司)觀察無熒光染色的各組細胞狀態；② 每孔加入1 mL Hoechst 33342，室溫避光染色15 min，吸棄染色液，PBS液洗3次，每次5 min，置于倒置熒光顯微鏡，觀察細胞形態學變化。

1.5細胞凋亡檢測取對數生長期的A549細胞，用亞硒酸鈉(0、2.5、5、10 μmol·L-1)培養24 h后，用PBS洗滌細胞2次，胰蛋白酶消化后，收集細胞，離心吸棄上清，加入195 μL Annexin V-FITC 結合液，輕輕重懸細胞，然后加入5 μL Annexin V-FITC，輕輕混勻，再加入10 μL碘化丙啶(PI)染色液，混合均勻。室溫避光孵育10～20 min，孵育過程中重懸細胞2～3次以改善染色效果，隨后置于冰浴中，立即用流式細胞儀(美國BD公司)檢測，AnnexinV-FITC為綠色熒光，PI為紅色熒光。

1.6氧化應激參數檢測ROS是細胞在代謝過程中產生的一系列活性氧簇， 是氧化應激反應的一個重要指標。MDA是脂質過氧化終產物之一，常作為評判脂質過氧化的指標。ROS導致的氧化應激反應是細胞凋亡中的一個重要環節，ROS的變化可以引發氧化還原反應，從而影響MDA水平的變化，最終誘發細胞凋亡[7]。用熒光探針DCFH-DA檢測細胞內ROS水平，用無血清的RPMI 1640培養基稀釋DCFH-DA，使工作液終濃度為20 μmol·L-1，37 ℃孵箱中避光溫育30 min，每個組別設6個復孔，置于激發波長為485 nm，發射波長為525 nm的多功能酶標儀上檢測，并且通過激光共聚焦顯微鏡(德國Zeiss公司)進行熒光成像分析。

將對數生長期的A549細胞用亞硒酸鈉(0、2.5、5、10 μmol·L-1)處理24 h后，BCA法測定樣本蛋白濃度后，按照試劑盒說明書進行操作，WST-1法檢測SOD活力，微量酶標法檢測GSH含量，硫代巴比妥酸法檢測MDA含量。

1.7Westernblot檢測A549細胞經藥物處理24 h后，終止細胞培養，吸除培養液，用PBS洗滌2次，每孔加入裂解液60 μL，置冰浴中裂解30 min，12 000 r·min-1離心7 min，獲得總蛋白樣品。根據核蛋白抽提試劑盒，獲取細胞質與細胞核蛋白。BCA比色法測蛋白濃度，蛋白定量后，在蛋白樣品中加入適量SDS-PAGE上樣緩沖液，100 ℃水浴變性10 min。取40 μg總蛋白上樣，經8%或10% SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，電轉至PVDF膜，用TBS-T稀釋的5%脫脂牛奶封閉2 h，加入抗體Keap1、Nrf2、HO-1、Lamin B和 β-actin，4 ℃孵育過夜(β-actin作為總蛋白和細胞質中內參蛋白，Lamin B作為細胞核中內參蛋白)，TBS-T洗膜3次，每次10 min，加入對應的熒光兔源或鼠源二抗，室溫孵育2 h，TBS-T洗膜3次，每次10 min，熒光影像分析儀(美國LI-COR公司)顯影和掃描。ImageJ 1.41軟件(美國Bethesda公司)進行數據分析。

2 結果

2.1亞硒酸鈉對A549細胞增殖的抑制作用Fig 1的MTT結果顯示，亞硒酸鈉具有抑制人肺腺癌A549細胞增殖的作用，隨著藥物濃度的增加，其抑制率也隨之增加(P<0.05)，提示亞硒酸鈉可抑制人肺腺癌A549細胞的增殖。

Fig 1 Inhibitory effects of sodium selenite on proliferation of A549

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group

2.2亞硒酸鈉對A549細胞形態的影響未經染色的人肺腺癌A549細胞見Fig 2A，隨著亞硒酸鈉濃度升高，變圓的細胞數量逐漸增加，細胞貼壁能力變弱，漂浮細胞數量增多，說明凋亡細胞不斷增加。Hoechst 33342熒光染色結果如Fig 2B所示，正常組細胞核完整，熒光著色分布均勻，熒光呈彌散狀態，未出現細胞凋亡現象；隨著亞硒酸鈉濃度的升高，細胞出現皺縮，細胞染色質呈顆粒熒光狀，細胞核呈折光性強的亮藍色小點，致密濃染，形態不規則且聚集成團，出現細胞凋亡的典型特點，說明亞硒酸鈉可誘導A549細胞凋亡。

2.3亞硒酸鈉對A549細胞凋亡的影響Fig 3的流式細胞術檢測結果表明，亞硒酸鈉可誘導人肺腺癌A549細胞凋亡，隨著亞硒酸鈉濃度的升高，凋亡細胞比例逐步增加，當亞硒酸鈉濃度為10 μmol·L-1時，人肺腺癌A549細胞凋亡率達到42.06%，與“2.2”結果相一致，進一步說明亞硒酸鈉具有誘導A549細胞凋亡的作用。

Fig 2 Effects of sodium selenite on morphology of A549 cells(×100)

A:Fluorescence photomicrograph of unstained A549 cells;B:Fluorescence photomicrograph of A549 cells stained with Hoechst 33342.

Fig 3 Effect of sodium selenite on apoptosis of A549

A:Effects of sodium selenite on apoptosis were determined using flow cytometry;B:Statistical analysis of the apoptotic rate.**P<0.01vscontrol group.

Fig 4 Effects of sodium selenite on oxidative stress of A549

A:ROS production was analyzed by laser confocal microscope(×200); B: ROS production was analyzed by multi-detection reader; C～E: Effects of sodium selenite on SOD,GSH and MDA activities.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

2.4亞硒酸鈉對氧化應激指標的影響如Fig 4A、4B所示，ROS的水平與亞硒酸鈉的濃度呈依賴性關系。隨著亞硒酸鈉濃度的不斷增加，ROS的產生量逐漸升高，綠色熒光逐漸增加。與對照組相比，亞硒酸鈉組ROS的產生量明顯升高，其中高、中濃度組ROS的增加量較低濃度組更為明顯，說明亞硒酸鈉誘導A549細胞凋亡與氧化應激反應有關，可能是通過促進ROS產生來實現的。MDA為脂質過氧化的代謝產物，其含量可以間接證明細胞氧化損傷的程度。SOD和GSH是體內非常重要的抗氧化劑和自由基清除劑，其含量可以間接反映細胞抗氧化損傷的能力。如Fig 4C～4E所示，與對照組相比，亞硒酸鈉各組MDA含量均明顯升高(P<0.01)，亞硒酸鈉組SOD、GSH含量明顯減少(P<0.01)。

2.5亞硒酸鈉對Keap1/Nrf2/ARE信號通路的影響如Fig 5所示，經過亞硒酸鈉處理的A549細胞，其Keap1、Nrf2和HO-1蛋白的表達明顯下降，蛋白的表達量與亞硒酸鈉濃度呈負相關，這也是亞硒酸鈉促進人肺腺癌A549細胞凋亡的重要原因。提示亞硒酸鈉通過調控Keap1/Nrf2/ARE信號通路，誘導A549細胞發生凋亡。

2.6亞硒酸鈉對Nrf2在細胞質和細胞核中表達的影響如Fig 6所示，隨著亞硒酸鈉濃度的升高，A549細胞胞核中Nrf2蛋白表達明顯下降，細胞質中Nrf2蛋白表達明顯上升，并且存在濃度依賴性。說明亞硒酸鈉抑制Nrf2從細胞質中遷移至細胞核，從而抑制Nrf2入核與下游的多效應靶基因ARE結合，使轉錄產物包括SOD、HO-1等多種抗氧化酶的表達降低，這與Fig 5結果相一致。因此，亞硒酸鈉誘導人肺腺癌A549細胞凋亡的機制與Keap1/Nrf2/ARE信號通路有關，同時可以抑制Nrf2發生核移位。

3 討論

肺癌是高發病率、高死亡率、預后最差的惡性腫瘤之一，嚴重威脅著人們的健康[8]。目前，臨床上的抗腫瘤藥物多數表現為價格昂貴、毒副作用大等缺點[9]，因此，尋找高效并且低毒的抗腫瘤藥物將成為國內外研究的重點。硒是動物的必需礦物質元素，是谷胱甘肽過氧化物酶的組成成分之一，可以保護細胞膜免受過氧化物的損害，作為自由基的捕獲劑，能夠防癌治癌，參與輔酶A和輔酶Q的生物合成過程，促進丙酮酸脫羧反應的進行[10]。除此之外，硒與許多生理生化過程密切相關，包括氧化還原穩態的生物合成，跨膜的離子通量調節和角蛋白完整性的維持[11]。

Fig 5 Effects of sodium selenite on protein expressions of Keap1/Nrf2/ARE pathway in A549

**P<0.01vscontrol group

Fig 6 Effects of sodium selenite on cytoplasmic and nuclear protein levels of Nrf2 in A549

**P<0.01vscontrol group

本研究MTT檢測顯示，亞硒酸鈉對人肺腺癌A549細胞的增殖具有抑制作用。通過倒置熒光顯微鏡對細胞形態學觀察、Annexin V-FITC/PI流式分析，證實了亞硒酸鈉具有促進人肺腺癌A549細胞凋亡的作用。從以上結果分析，亞硒酸鈉可能通過對人肺腺癌A549細胞生長的抑制作用，促進細胞凋亡。

氧化應激相關的實驗結果提示，亞硒酸鈉可能通過消耗A549細胞中的SOD和GSH含量，降低其抗氧化能力，誘導A549細胞發生氧化應激反應，同時產生大量的ROS，導致細胞MDA含量增加，從而抑制了人肺腺癌A549細胞增殖。說明亞硒酸鈉對人肺腺癌A549細胞的殺傷能力與細胞內氧化應激反應之間存在一定的相關性。

Keap1/Nrf2/ARE信號通路是迄今為止最重要的抗氧化通路[12]，參與體內氧化應激反應[13]。Nrf2與Keap1解離后進行活化，活化后的Nrf2進入細胞核內，與ARE相結合，啟動下游Ⅱ相解毒酶、抗氧化蛋白類、蛋白酶體以及泛素酶的基因表達[14]。Western blot結果顯示，亞硒酸鈉下調人肺腺癌A549細胞中Keap1、Nrf2和HO-1蛋白的表達，并且隨著亞硒酸鈉濃度的增加，Keap1、Nrf2和HO-1蛋白的表達降低。同時細胞核中Nrf2蛋白表達隨著亞硒酸鈉濃度的增加而降低，而細胞質中Nrf2蛋白表達與其相反。這說明亞硒酸鈉致人肺腺癌A549細胞的凋亡可能與Keap1/Nrf2/ARE信號通路有關，并且該通路發揮作用的機制可能與亞硒酸鈉抑制Keap1/Nrf2/ARE中Nrf2發生核轉位密切相關。

綜上所述，亞硒酸鈉通過抑制人肺腺癌A549細胞增殖，誘導細胞凋亡，調節細胞內氧化應激反應，調控Keap1/Nrf2/ARE抗氧化信號通路，從而促進人肺腺癌A549細胞凋亡，這對亞硒酸鈉在腫瘤防治方面的研究具有重要的指導意義。此外，本研究初步探索了亞硒酸鈉誘導人肺腺癌A549細胞凋亡的作用及可能的分子機制，以期為亞硒酸鈉臨床用藥提供可靠的理論基礎和實驗依據。