結核感染患者外周血中性粒細胞自噬水平的研究

杜金艷，王 燕，張 燕，陳 敏，鄧少麗，陳 鳴,唱 凱

(陸軍軍醫大學第三附屬醫院檢驗科，重慶 400042)

結核病作為當今世界重要的傳染病之一，嚴重威脅人類健康。據統計，全球約1/3的人感染過結核分枝桿菌(MTB)[1]。然而在眾多的感染人群中，絕大多數并不表現出任何臨床癥狀，僅有約10%的感染者會在一生中的某個時間段發展成為結核病[2]。

自噬，是將細胞內功能不全的細胞器和蛋白質運輸到溶酶體進行降解的一種方式，同時也在免疫和炎癥中起主要作用。當MTB入侵免疫細胞后會誘導抗炎和(或)促炎細胞因子的釋放，調節自噬相關蛋白的表達，抑制或誘導細胞自噬對MTB的清除。Beclin1和微管相關蛋白輕鏈3(MAPLC3)是編碼自噬相關蛋白的重要基因，并且LC3是自噬體膜上的標記蛋白，長期穩定存在直至與溶酶體相結合，常作為自噬體的標記分子。研究發現，嗜中性粒細胞通過產生更高水平的活性氧(ROS)，增加其吞噬體的pH值并引起結核分枝桿菌自噬，進而介導記憶性CD8+T細胞的殺菌活性，表明嗜中性粒細胞在結核感染過程中發揮重要作用[3-4]。目前關于中性粒細胞自噬水平在結核感染中的作用鮮有研究報道，且自噬相關基因Beclin1在中性粒細胞中所誘導的自噬是否參與人體對結核分支桿菌的調控仍不清楚。據此，本研究從自噬這一細胞的自發性防御機制著手，通過分析結核感染患者外周血中中性粒細胞LC3及Beclin1 mRNA的表達情況，深入探究中性粒細胞在結核病的發病機制過程中的作用，為MTB的預防及治療提供理論依據。

1 資料與方法

1.1一般資料 依據肺結核診斷標準(WS288-2008)，選擇2016年12月至2017年6月在重慶市公共衛生醫療救治中心和陸軍軍醫大學第三附屬醫院就診的初治結核病患者，共24例，健康對照組選擇在該區域中無血源關系的同期入院患者，無肺結核癥狀或體征，實驗室及影像學檢測均未提示為肺結核者，共16例。排除疾病情況：免疫抑制劑使用者、合并其他感染性疾病、自身免疫性疾病、腫瘤等疾病。

1.2方法

1.2.1標本采集 分別抽取活動性結核組、健康對照組空腹外周血3～5 mL于EDTA抗凝管，3～6 h內檢測自噬水平后分離目的細胞提取總RNA。

1.2.2引物的查找與選擇 通過查找Beclin1基因數據信息和文獻，利用Primer5.0軟件設計PCR擴增引物，如表1，采用GAPDH基因作為內參基因。

表1 PCR 引物及擴增片段

1.2.3采用流式細胞術進行自噬水平檢測 Flow CellectTM Autophagy LC3 Antibody-based Assay Kit，自噬檢測試劑盒購Millipore公司，儀器為BECMAN，按試劑盒和儀器要求進行操作。

1.2.4外周血中性粒細胞提取 細胞分離試劑購自Thermo Fisher Scientific公司，具體操作步驟如下：(1)取紫頭管全血1∶1加入1640培養基稀釋，混勻備用；(2)依次加入75%Percoll、60%Percoll 各4 mL于15 mL離心管，加入時不能有任何上層液體沖入下層的情況；(3)將混勻的稀釋血液加入最上層；(4)450 g離心20～25 min；(5)液體分3層，最上一層與中間層之間細胞多為淋巴細胞。最下層與中層細胞為中心粒[5]；(6)用滴管吸出目的細胞，加入新15 mL離心管，加1640培養基，補充至14 mL；(7)450 g離心10 min，棄上清；(8)用1 000 μL PBS重懸；(9)轉移至1.5 mL EP管，1 000 r/min，離心5 min(4 ℃低溫高速離心機)，棄上清(瑞氏染色后顯微鏡計數，觀察有無中性粒細胞，拍照保存)；(10)加入1 000 μL PBS，1 000 r/min，離心5 min(4 ℃低溫高速離心機)，棄上清，加入400 μL，按1∶3加入1 mL Trizol溶液，反復震蕩，做好標記，存放于-80 ℃超低溫冰箱，待提取RNA。

1.2.5RNA的提取及質量檢測 取出保存樣本室溫解凍，提取總RNA。在ThermoND-1000上進行OD260/OD280檢測，選擇RNA在1.8～2.0范圍內的樣品用于熒光定量PCR反應，剩余的RNA溶液于-80 ℃保存備用。

1.2.6逆轉錄合成cDNA及熒光定量PCR 試劑盒購自Roche公司，將模板RNA及相應試劑解凍，逆轉錄PCR儀為ABI，程序為：(1)逆轉錄延伸：37 ℃，60 min；(2)滅活逆轉錄酶：85 ℃，5 min。取出產物，迅速置冰浴5 min；2～8 ℃保存1～2 h或在BIO-RAD(CFX-96)上立即進行熒光定量，擴增程序為：95 ℃，10 min；95 ℃(20 s)→60 ℃(20 s)→72 ℃(20 s)→40個循環。

2 結 果

2.1一般臨床資料 本次臨床標本收集健康對照組樣本16例，其中成年男性6例，平均年齡為(42.96±3.52)歲；成年女性10例，平均年齡為(49.40±5.33)歲；活動性結核組樣本24例，其中成年男性19例，平均年齡為(42.96±3.52)歲；成年女性5例，平均年齡為(49.40±5.33)歲。活動性結核組與健康對照組相比，年齡差異無統計學意義(P=0.165 5，P>0.05)；活動性結核組男性(79.2%)比例明顯高于健康對照組(37.5%)。

2.2自噬水平比較 采用流式細胞術對活動性結核組和健康對照組外周血中性粒細胞和單個核細胞的自噬水平進行檢測，分析在單個核細胞、中性粒細胞中LC3的表達情況。活動性結核組單個核細胞自噬水平與健康對照組相比，差異無統計學意義(P=0.784 2，P>0.05)；中性粒細胞自噬水平明顯低于健康對照組，差異有統計學意義(P=0.013 8，P<0.05)，見圖1～6。

圖1 健康對照組單個核細胞自噬水平

圖2 活動性結核組單個核細胞自噬水平

圖3 兩組單個核細胞自噬水平比較

圖4 健康對照組中性粒細胞自噬水平

2.4中性粒細胞Beclin1 mRNA的表達水平 采用實時熒光定量PCR對活動性結核組和健康對照組外周血中性粒細胞Beclin1 mRNA進行檢測。以活動性結核組結果為1，發現活動性結核組中性粒細胞Beclin1 mRNA相對內參基因表達低于健康對照組(如圖7)，差異有統計學意義(P<0.001)。

圖5 活動性結核組中性粒細胞自噬水平

圖6 兩組中性粒細胞自噬水平比較

圖7 Beclin1 mRNA相對表達情況

3 討 論

自噬，在維持細胞內穩態以及物質的循環利用上具有重要作用。雙層膜結構包被細胞質形成自噬小體，與溶酶體融合形成自噬溶酶體，將內容物進行降解，對細胞內外的細微變化能迅速做出反應，有利于細胞快速適應環境變化[6-7]，按照方式不同可分為大自噬、小自噬和分子伴侶介導的自噬。自噬是機體免疫非常重要的環節，它既可以直接殺滅MTB，又可以為抗原提呈啟動細胞免疫作準備[8]。中性粒細胞，作為機體主要的免疫細胞之一，MTB感染后，迅速從外周血遷移到感染灶，活化并吞噬MTB，并通過NADPH氧化酶介導產生大量ROS，對吞噬的MTB起到快速有效的殺滅作用，但同時也會促進中性粒細胞自身的壞死，造成MTB的免疫逃逸[9]。

本研究發現，活動性結核組男性比例明顯高于健康對照組，差異有統計學意義。在男性中，吸煙、飲酒以及重體力勞動比例高于女性，以上危險因素可能降低機體免疫功能，顯著增加男性結核病的發病風險[10-11]。活動性結核組中性粒細胞自噬水平(LC3)及Beclin1基因表達明顯低于健康對照組。LC3是目前對自噬具有高度特異性的標志物，參與自噬體隔離膜的形成。MTB感染免疫細胞后，LC3-1型(胞質型)轉變為LC3-2型(胞膜型)，通過對其定位可反映細胞的自噬水平。Beclin1基因是第一個被鑒定的自噬基因，是酵母自噬基因ATG6的同源物，是參與自噬調控的重要基因[12]。結核病的發生是由T淋巴細胞介導的細胞免疫反應，體液免疫產生的抗體對其作用局限，故推測活動性結核組自噬水平的降低及Beclin1基因表達的下調與MTB感染及破壞機體免疫系統有關。但也有研究發現，Beclin1蛋白可以激活mTOR蛋白，從而抑制細胞的自噬[13]。

中性粒細胞具有吞噬并殺滅細胞內結核分支桿菌的作用，而且這種殺菌機制與MTB感染同LC3蛋白減少有關，從而推斷中性粒細胞也直接參與抗結核分枝桿菌免疫。目前，關于Beclin1基因對中性粒細胞所誘導的自噬與MTB感染調控的研究較少，機制并不清楚，隨著對自噬進一步的研究，可深入了解中性粒細胞自噬情況在結核病發生發展的具體過程，為結核病的治療提供新的靶向治療方案。

4 結 論

目前關于結核感染患者外周血中性粒細胞自噬水平在結核感染中報道較少，本研究從細胞自發性防御機制著手，分析中性粒細胞中自噬標志性蛋白LC3水平及相關基因Becline 表達，發現結核感染患者外周血中性粒細胞自噬水平LC3降低，且Becline基因表達的下調，可能與結核病的發生發展有密切關系。