肺炎克雷伯菌動物感染模型及在中藥抗感染應用中的研究進展

趙 娟,劉志遠 綜述，劉貴建 審校

(中國中醫科學院廣安門醫院檢驗科，北京 100053)

肺炎克雷伯菌是革蘭陰性菌，屬腸桿菌科，于1882年由FRIEDLANDER在肺炎患者的肺中分離得到的[1]。該菌在環境中無處不在，經常在胃腸道和醫療設備中被發現，在重癥監護病房(ICU)的暴發流行中，占革蘭陰性菌感染的15%以上[2]。在人類宿主上，根據基因不同將肺炎克雷伯菌分為3類：機會致病菌、高毒力菌和碳青霉烯耐藥菌。機會致病菌感染危重和免疫功能低下患者，是醫院內感染的主要原因之一，包括肺炎、泌尿道感染和血流感染；高毒力菌感染社區健康人群，引起嚴重感染，包括膿性肝膿腫、眼內炎和腦膜炎等[3]。有研究表明，肺炎克雷伯菌還可引起心內膜炎、手術傷口或其他傷口感染等[2]。隨著醫院內感染率的上升及碳青霉烯耐藥性的出現，肺炎克雷伯菌引起的感染性疾病受到廣泛關注。學者們將目光聚焦到了耐藥逆轉劑——中藥來逆轉抗菌藥物耐藥問題，在體外研究方面取得了良好效果，在體內實驗研究中動物模型的作用日漸凸顯。

1 動物模型的應用及影響因素

長期以來，動物模型用來研究致病菌的致病因子和機制，因此，對傳染病的研究是一個有價值的工具[4]。近年來，使用多種不同物種建立肺炎克雷伯菌肺炎模型的文獻報道較多，同時，其他感染模型也不斷出現，其對理解肺炎克雷伯菌的致病性和宿主免疫應答至關重要。事實上，這些動物模型的建立和應用提供了大量關于肺炎克雷伯菌發病機制的知識，同時，也可用于初步評價藥物作用效果。

動物模型的影響因素主要有2個方面：(1)動物品系的選擇，動物模型的應用可更好地模擬致病菌感染引起的炎癥類型，但卻不能精確地反映機體的免疫應答。同樣，肺炎克雷伯菌的動物感染模型也存在這一問題。因此，選擇合適的實驗動物顯得尤為重要。(2)菌種的選擇，大多數實驗動物模型使用的菌株是從臨床分離到的,其生物學性質和流行特點未知,且不同菌株的毒力差別很大,從而導致引發的病死率、組織細菌載量和炎癥細胞因子水平等存在顯著差異。因此，雖然體內實驗具有體外實驗無法比擬的優點，但實驗時選擇合適的動物及菌種值得引起關注[5]。目前，肺炎克雷伯菌已建立的體內感染模型有肺炎感染模型、膿毒血癥感染模型、皮膚及軟組織感染模型、腦膜炎感染模型和非哺乳動物感染模型。

2 肺炎克雷伯菌動物感染模型

2.1肺炎感染模型 肺炎克雷伯菌是醫院獲得性肺炎(入院≥48 h)的主要病原菌，也是ICU呼吸機相關性肺炎(VAP)的主要條件致病菌[6]。VAP占醫院獲得性肺炎的絕大比例，其可能與患者進入ICU的時間、機械通氣時間及基礎性疾病等有關[7]。近年來，肺炎克雷伯菌肺炎感染模型的文獻報道較多，常用動物及其被接種的菌液濃度和劑量為大鼠(1.5×1012～1.2×1014CFU/L，100～400 μL)、小鼠(1×1010～1×1011CFU/L，20～50 μL)和豚鼠(1×1012CFU/L，200 μL)。造模主要采用氣管插管、氣管切開和鼻黏膜滴入3種方法。氣管插管是將小鼠麻醉后行氣管插管，將菌液送入氣管，最后直立小鼠使菌液自然流入肺部[8]。此方法能保證受試動物接種菌量的一致性，但不能保證盲插的成功率。趙振江等[9]在此基礎上進行了技術改良，在小兒喉鏡和鼻鏡的輔助下將帶導絲的導管插入麻醉大鼠的氣管，菌液經導管進入氣管，成功建立肺炎模型。陳業民等[10]于無菌操作下麻醉大鼠，頸部除毛暴露氣管，切開氣管，注射從慢性支氣管炎患者痰液中分離到的肺炎克雷伯菌液，成功建立了肺炎克雷伯菌肺炎模型。此方法需要行氣管切開術，對動物造成損傷的同時也增加了動物模型存活率降低的風險。鼻黏膜滴入即直接將菌懸液緩緩滴入已麻醉的大鼠鼻腔內[11]。目前，以上3種造模方法均被廣泛使用，尚無法證明哪種方法更優。此外，為有利于感染，也有研究采用白細胞減少或環磷酰胺處理的免疫抑制鼠模型，經滴鼻感染成功構建免疫抑制肺炎克雷伯菌肺炎小鼠模型[12-13]。肺炎克雷伯菌肺炎感染模型在中醫中藥的科學治療方法方面也應用廣泛。李鳳玲[14]從肺炎患者唾液中分離到肺炎克雷伯菌臨床株，培養后經大鼠氣管滴入，成功構建了大鼠急性重癥肺炎模型，用羊耳菊(含黃酮類和萜類化合物，以及咖啡酰基奎寧酸)水提物灌胃治療6 d后發現，不同劑量羊耳菊水提物能改善大鼠動脈血氣指標，降低白細胞及中性粒細胞水平，降低肺組織腫瘤壞死因子-α、白細胞介素-1β、白細胞介素-6、髓過氧化酶(MPO)水平及核因子κB (NF-κB)p65、磷酸化p38絲裂原活化蛋白激酶(p-p38MAPK)蛋白水平，表明羊耳菊水提物可成為一種天然有效的抗炎藥。MEI等[15]用同樣的造模和給藥方式證明,毒素清顆粒也通過NF-κB/絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路降低了肺炎克雷伯菌大鼠肺炎模型的肺組織病理損傷和炎癥反應。肖雪琴等[11]經鼻滴入1×109CFU/mL肺炎克雷伯菌30 μL(分2次接種)，構建耐藥SD大鼠肺炎模型。給予雙黃連或雙黃連與頭孢他定聯合灌胃治療(每天灌胃2次，間隔6～8 h),連續治療3 d，聯合治療組大鼠在臨床表現上痊愈，肺內活菌數及活菌的最低抑菌濃度較2個單獨治療組和磷酸鹽緩沖液對照組顯著降低，差異均有統計學意義(P<0.05)，提示中藥雙黃連可逆轉肺炎克雷伯菌對頭孢他啶的耐藥。

2.2膿毒血癥感染模型 肺炎克雷伯菌已成為膿毒血癥感染的第二大細菌[16]。為更好地研究其發病機制與治療方案，有研究建立了肺炎克雷伯菌膿毒血癥感染模型，即將菌懸液經靜脈、肌內或腹腔內等途徑注射入動物體內，引起局部或全身炎性反應來達到引發膿毒癥的臨床表現。在該模型中，嚙齒類動物特別是大、小鼠較為常用，已報道的有血容量高達10.75 mL/100 g的BALB/C鼠[17]，以及近交系小鼠C57BL/6和C3H/HeJ[18-19]。但由于近交系缺乏隱性疾病易感基因的遺傳異質性，有研究選用了封閉群小鼠[20]，其能模擬人類遺傳背景，被廣泛用于免疫學、毒性及藥效等方面的研究，但其結果難以重現。肺炎克雷伯菌膿毒血癥感染模型接種相對簡單、可較好地模擬人體感染肺炎克雷伯菌的一系列癥狀，如炎癥細胞因子水平變化、細菌從原發部位感染到全身炎癥反應綜合征的演變過程等。因此，通常用于相關研究、評價疫苗免疫及抗菌藥物作用的效果等[18,21]。然而，隨著中醫中藥抗感染作用逐漸被重視，此模型也已大量用于評價中藥療效方面。QAMAR等[22]將1×105CFU/mL產新德里金屬β內酰胺酶-1(NDM-1)的肺炎克雷伯菌ST11的菌液100 μL經側尾靜脈注射到BALB/C鼠體內，感染3 h后再經側尾靜脈每12 h分別給予低劑量和高劑量的麥盧卡(藥用植物)蜂蜜，持續治療2周，在治療后第7、15天尾靜脈取血培養計數細菌，小鼠猝死后取肝、脾、腎用于組織學分析。結果顯示，治療后細菌載量出現時間依賴性大量降低(>1 log)，同時，在肝、腎和脾臟僅觀察到輕、中度的形態學改變，提示麥盧卡蜂蜜治療產NDM-1酶的肺炎克雷伯菌ST11的有效性。

2.3皮膚及軟組織感染模型 肺炎克雷伯菌也會引起皮膚及軟組織感染，其主要用于評價藥物療效。據統計，ICU中由肺炎克雷伯菌導致的皮膚及軟組織感染達3%[23]。皮膚燒傷感染模型在大、小鼠中均有建立。建模時小鼠或大鼠背部實驗區依次進行皮膚脫毛、麻醉、消毒等，再用熱金屬塊制造燒傷面(持續30 s或45 s)。在創面部位皮下接種或局部均勻涂布菌液，完成肺炎克雷伯菌燒傷感染模型的建立[24-25]。軟組織感染模型有3種方法：(1)接種前腹腔注射環磷酰胺獲得白細胞減少的小鼠模型，在此基礎上大腿肌內注射107CFU/mL的菌懸液100 μL，成功構建免疫抑制的肺炎克雷伯菌小鼠大腿感染模型，通過測定大腿肌肉中細菌數量來評價藥物療效[26]。(2)創傷感染模型，即將小鼠麻醉后經背部脫毛、消毒處理，用手術刀切除覆蓋胸椎脊柱的全層皮膚及皮下組織，再將肺炎克雷伯菌液涂于創面，3 min后剪傷口大小的透明敷料置于傷口處待與組織黏合。這也是目前研究藥物抗肺炎克雷伯菌引起的軟組織感染常用的模型[27]。(3)用皮下囊腫技術來模擬膿腫，如FUURSTED等[28]所描述的，先于雄性Wistar大鼠背部注射空氣制造一個囊腫，然后向囊腫內注射1 mL油混合物，7 d后再向皮下囊腫內注射肺炎克雷伯菌與5%胃黏蛋白的混懸液。該模型的優勢是允許在不同時間點多次收集皮下液體，持續監測菌液濃度及機體的免疫應答。

2.4腦膜炎模型 革蘭陽性肺炎鏈球菌感染引起的大、小鼠和兔腦膜炎模型早有建立[29-31]，但革蘭陰性肺炎克雷伯菌感染引起的腦膜炎動物模型卻鮮見文獻報道。WEN等[32]構建了肺炎克雷伯菌腦膜炎大鼠模型，提示中樞神經系統肺炎克雷伯菌感染后神經膠質細胞是促炎性細胞因子的重要早期來源。在該模型中，雄性SD大鼠采用戊巴比妥麻醉后固定頭部，正中矢狀位切開頭皮后將患者腦脊液培養出的肺炎克雷伯菌液接種到大鼠側腦室，于不同時間點收集腦脊液，計數白細胞并檢測細胞因子水平。CHIU等[33]也建立了相同的模型，并證明了皮質激素在肺炎克雷伯菌腦膜炎時的神經保護作用。大鼠腦膜炎模型的優勢在于可多次采樣腦脊液進行相關指標檢測。

2.5非哺乳動物感染模型 除哺乳動物外，有研究還建立了肺炎克雷伯菌非哺乳動物感染模型，如大蠟螟、秀麗隱桿線蟲和盤基網柄菌。與哺乳動物比較，非哺乳動物感染模型雖不能模擬機體免疫應答及疾病進程，但因其成本低、不存在動物倫理問題、且易于進行大量實驗，因此，更適合高通量篩選細菌突變體[5]。大蠟螟幼蟲能在37 ℃下快速繁殖，因此，可用于人體正常體溫下，肺炎克雷伯菌致病性及體內抗菌療效的研究。造模時大蠟螟幼蟲無需麻醉，直接用25 μL的微量注射器從腹足給菌給藥[34-35]。秀麗隱桿線蟲是一種以細菌為食的模式生物，因其具有遺傳背景清楚、個體結構簡單、生活周期短等優點，已被廣泛用于研究病原菌的致病機制及篩選新抗感染藥物。王訊等[36]在液體條件下，用臨床分離的肺炎克雷伯菌感染線蟲分別于感染后第4、6、12、24 h鑒定線蟲腸道內細菌并計數細菌數，成功構建立了肺炎克雷伯菌-秀麗隱桿線蟲感染模型。而盤基網柄菌是生活在含豐富有機物土壤中的一種變形蟲,其阿米巴原蟲的形式與人類吞噬細胞具有很多共同特點,主要用于測定肺炎克雷伯菌抵抗機體吞噬作用的基因及突變株的毒力[37]。

3 展 望

近年來，耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌的出現給臨床治療帶來了極大的困難，同時，也引起了全球學者的廣泛關注。隨著中醫中藥的科學治療逐漸被重視，中藥作為耐藥逆轉劑的研究也越來越多，其中動物模型的作用不容忽視。鑒于中藥治療具有起效慢、療程長等特點，理想的用于中藥抗感染研究中的動物模型應滿足以下條件：(1)受試動物易獲得、易飼養、價格低廉且對細菌的耐受性高；(2)造模簡便，所建模型穩定，存活時間長且能進行多次取樣；(3)所建模型能模擬臨床疾病的演變過程等。目前，已成功建立的肺炎克雷伯菌感染模型有肺炎感染模型(大、小鼠和豚鼠)、膿毒血癥感染模型(大、小鼠)、燒傷及軟組織感染模型(免疫缺陷鼠)、腦膜炎感染模型(大鼠)及非哺乳動物感染模型(大蠟螟、秀麗隱桿線蟲和盤基網柄菌)。其在模擬人體感染性疾病中具有優點也有局限。因此，要想更真實地模擬人類疾病進程就要根據不同的造模目的選擇合適的動物。