卡氏肺孢子菌肺炎大鼠中的LAMP檢測方法及1,3-β-D葡聚糖變化的研究*

帕提古麗·那吾爾，劉媛媛，烏蘭·同巴依爾，牛曉琳，朱 輝

(新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院消毒配送中心次供應(yīng)室一部，新疆烏魯木齊 830054)

肺孢子菌肺炎(PCP)是獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)患者最常見的機會性感染疾病，也是該類患者致死的重要原因[1]。PCP是由卡式肺孢子菌(PC)感染引發(fā)的一種疾病。目前臨床上診斷PCP的主要方法是病原學檢測、免疫學診斷和分子學診斷[2]。病原學檢測是最常用的方法，被稱為“金標準”，此方法特異度高，但是較繁瑣、檢出率低。免疫學診斷具有特異度好，檢出率高的優(yōu)點，但是成本較高[3]。分子學診斷方法主要是聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)，特異度好，但是需要專門的試劑和貴重儀器。環(huán)介導恒溫擴增法(LAMP)指在等溫環(huán)境下，30～60 min內(nèi)進行核酸擴增，擴增過程中出現(xiàn)焦磷酸鎂沉淀，肉眼可判斷結(jié)果[4]。LAMP法靈敏度高，最低檢測限為10個拷貝。張楠等[5]發(fā)現(xiàn)LAMP方法特異度高，靈敏度高于PCR方法，反應(yīng)時間較短，臨床使用時不需要特殊儀器，操作較簡單。1,3-β-D葡聚糖(BDG)是真菌細胞壁的主要成分之一。研究發(fā)現(xiàn)BDG與深部真菌感染關(guān)系密切[6]。本研究通過構(gòu)建卡式PCP大鼠模型，建立LAMP法檢測模型大鼠體內(nèi)PC，同時測定BDG，旨在探討LAMP檢測方法在卡式PCP大鼠中的可行性及BDG水平的變化。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 Wister大鼠，SPF級，雌性，200～220 g左右，購自上海斯萊克動物中心。生產(chǎn)許可證為SCXK(滬)2017-0005，實驗動物許可證為SYXK2015-009。

1.1.2主要試劑 地塞米松磷酸鈉注射液(金耀，天津金耀藥業(yè)有限公司，國藥準字H2020514)；四環(huán)素片(華南，廣東華南藥業(yè)集團有限公司，國藥準字H44020690)；無內(nèi)毒素質(zhì)粒小提中量試劑盒[天根，貨號DP118，天根生化科技(北京)有限公司]；PMD18-T Vector試劑盒[寶生物，貨號6011，寶生物工程(大連)有限公司]；Bst DNA聚合酶(KALANG，貨號KL-D7887，上海康朗生物科技有限公司)；瓊脂糖(Spain，貨號A8201，北京索萊寶生物科技有限公司)；大鼠1,3-β-D葡聚糖ELISA試劑盒購自基爾頓生物科技(上海)有限公司；SYBR GreenⅠ核酸染料購自上海美季生物技術(shù)有限公司；引物由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成。

1.1.3主要儀器 DNA電泳儀購自孚光精儀(中國)有限公司；DKT200-2恒溫金屬浴購自廣州華韻生物科技有限公司；臺式高速離心機購自北京泰澤瑞達科技有限公司；KEFS-1高速組織勻漿機購自上海艾黎化學科技有限公司。

1.2方法

1.2.1PCP模型構(gòu)建 40只Wister大鼠分成肺炎感染組和對照組，每組各20只。對肺炎感染組大鼠進行腹腔注射地塞米松磷酸鈉注射液3.5 mg/只，2次/周，期間為防止細菌感染，給予肺感染大鼠含四環(huán)素的飲水(1 g/L)，對照組大鼠腹腔注射同等劑量無菌生理鹽水，連續(xù)注射8周，8周后停止注射。期間隨時觀察兩組大鼠的活動、飲水和飲食情況，記錄大鼠存活數(shù)，每2周稱量體質(zhì)量。停止地塞米松磷酸鈉注射液后，取肺炎感染組大鼠右肺中葉制成肺印片進行GMS染色，油鏡下觀察并發(fā)現(xiàn)肺組織中存在典型的肺孢子菌包囊，則認為PCP模型構(gòu)建成功。

1.2.2實驗樣本的采集 構(gòu)建模型前，每組各取6只大鼠稱重，使用乙醚進行麻醉后心臟取血1 mL，離心后取血清備用。解剖各組大鼠，取肝臟、腸系膜淋巴結(jié)及完整的肺組織并稱重，計算肺重/體質(zhì)量比。參照相關(guān)文獻[7]的方法，對大鼠進行支氣管肺泡灌洗，采用離心管收集灌洗液，離心收集上清備用。到第8周時兩組各處死10只大鼠，麻醉后心臟取1 mL血，離心后取血清備用。解剖大鼠取肝臟、腸系膜淋巴結(jié)及完整的肺并稱重，計算肺重/體質(zhì)量比。收集灌洗液，方法同上。

1.2.3引物設(shè)計 從 GeneBank獲得卡式肺孢子菌核內(nèi)核糖體小亞基16s rRNA的基因序列(X12708)，使用DNA man軟件與人肺孢子菌(AB266392)、念株菌屬(E15168)、酵母菌屬(Z75578)和小鼠肺孢子菌(AY532651)等的16s rRNA進行比對，選擇一段保守性好的基因片段。利用Primer5軟件設(shè)計16s rRNA 特異度 LAMP引物。見表1。

表1 LAMP 引物及堿基序列

1.2.4質(zhì)粒構(gòu)建 使用引物F3、B3進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物與PMD18-T載體連接后轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細胞中，提取重組質(zhì)粒PMD18-T-16s rRNA。

1.2.5LAMP反應(yīng)體系 本實驗采用25 μL反應(yīng)體系，包括10×buffer 2.5 μL，dNTPs 2 μL，MgCl23.2 μL，LoopF和LoopB引物各0.16 μL，F(xiàn)IP和BIP引物各0.32 μL，F(xiàn)3和B3引物各0.04 μL，BST DNA 聚合酶0.8 μL，將反應(yīng)混合物混勻后，再分別加入模板(質(zhì)粒模板或者組織DNA)2 μL，SYBR GREENⅠ0.5 μL，加雙蒸水至25 μL，混勻后點離，放置于63 ℃恒溫水浴1 h。取5 μL進行2%瓊脂糖凝膠電泳，觀察電泳和顏色變化結(jié)果。

1.2.6酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)法檢測血清和肺灌洗液中BDG 嚴格按照1,3-β-D葡聚糖ELISA試劑盒說明書步驟進行檢測。

2 結(jié) 果

2.1兩組大鼠的一般情況比較 構(gòu)建大鼠過程中發(fā)現(xiàn)肺炎感染組大鼠出現(xiàn)飲食飲水減少、反應(yīng)變遲鈍、斑塊狀脫毛、眼球顏色變暗、眼睛和鼻子炎性分泌物增多等現(xiàn)象。注射地塞米松8周后，肺炎感染組大鼠死亡4只，死亡率為28.57%。與對照組比較，肺炎感染組大鼠體質(zhì)量從第6周開始明顯下降，持續(xù)到第8周，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖1。

注：與對照組比較，*P<0.05

圖1兩組大鼠的體質(zhì)量比較

2.2兩組大鼠肺重及肺重/體質(zhì)量比比較 注射地塞米松前兩組大鼠肺重和肺重/體質(zhì)量比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與注射地塞米松前比較，注射地塞米松8周后肺炎感染組肺重和肺重/體質(zhì)量比明顯上升，且觀察組注射地塞米松8周后肺重和肺重/體質(zhì)量比高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，具體結(jié)果見表2。

表2 兩組大鼠肺重及肺重/體質(zhì)量比比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與同組注射地塞米松前比較，#P<0.05

表3 兩組大鼠各組織卡式肺孢子菌LAMP檢測結(jié)果[n/n(%)]

注：與對照組比較，*P<0.05；與肺組織比較，#P<0.05

2.3兩組大鼠各組織卡式肺孢子菌LAMP檢測結(jié)果 注射地塞米松前，對兩組大鼠(n=6)肺組織、肝組織和腸系膜淋巴結(jié)進行LAMP檢測，熒光為棕黃色，判定PC感染為陰性。注射地塞米松8周后，對照組大鼠3種組織LAMP熒光為棕黃色，判定PC感染為陰性；肺炎感染組大鼠均有組織DNA LAMP熒光為綠色，判定PC感染為陽性，其中肝組織和腸系膜淋巴結(jié)PC檢出率低于肺組織，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，與對照組比較，肺炎感染組肺組織檢出率升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，肝和腸系膜淋巴結(jié)檢出率比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具體結(jié)果見表3。

2.4兩組大鼠外周血和肺灌洗液BDG水平比較 注射地塞米松前兩組大鼠外周血和灌洗液的BDG水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。注射地塞米松8周后肺炎感染組外周血和肺灌洗液BDG水平表達均上升，均高于對照組，且肺灌洗液BDG水平高于外周血，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，具體結(jié)果見表4。

表4 兩組大鼠外周血和肺灌洗液BDG水平比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與注射地塞米松前比較，#P<0.05；與外周血比較，△P<0.05

3 討 論

肺炎主要是病原體所引發(fā)的疾病，如：真菌、細菌、支原體、衣原體和病毒等[8]。PC屬于機會性致病真菌的一種，可導致PCP的發(fā)生。近些年來隨著艾滋病、腫瘤和自身免疫性疾病患者人數(shù)的增加，PCP的致死率也逐年增加[9]。研究報道，PCP與慢性阻塞性肺病(COPD)發(fā)生存在關(guān)系[10]。目前臨床上PC的檢測方法主要為病原學檢查，該方法具有良好的特異度，但是耗費時間較長[11]。LAMP是一種等溫核酸擴增方法，敏感性高。研究發(fā)現(xiàn)，LAMP靈敏度、特異度和檢出率與巢氏PCR和實時定量熒光PCR無明顯差異[12]。因此將LAMP檢測方法運用于PCP檢測，對于該疾病的早期診斷和預后都具有重要的意義。

本研究采用腹腔注射地塞米松的方法構(gòu)建PCP模型，建模過程中發(fā)現(xiàn)肺炎感染組大鼠出現(xiàn)飲食飲水減少、反應(yīng)變遲鈍、斑塊狀脫毛、眼球顏色變暗、眼睛和鼻子炎性分泌物增多等現(xiàn)象。注射地塞米松8周后，肺炎感染組大鼠死亡4只，死亡率為28.57%。與對照組比較，肺炎感染組大鼠體質(zhì)量從第6周開始明顯下降，持續(xù)到第8周，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結(jié)果提示了模型大鼠病情隨建模時間延長而加重，也側(cè)面驗證了模型構(gòu)建成功。孫艷等[13]也發(fā)現(xiàn)卡氏PCP模型大鼠隨著建模時間病情會加重，出現(xiàn)體質(zhì)量減輕、反應(yīng)遲鈍等情況。目前國外已經(jīng)開展LAMP檢測肺孢子菌，但是國內(nèi)還在構(gòu)建LAMP檢測方法階段[14]。本研究在PCP大鼠模型上運用LAMP技術(shù)檢測到PC感染，檢出率為100%，而對照組各組織均未檢測到PC感染。結(jié)果提示此方法具有高特異度，結(jié)果可靠，不存在假陽性。值得一提的是，PCP組10只大鼠肺組織均檢測到PC感染，各有1只肝臟組織和腸系黏膜組織也檢測到PC感染，其原因可能是PC在PCP疾病后期發(fā)生了轉(zhuǎn)移擴散，這需要后期大量實驗驗證。

BDG檢測主要用于系統(tǒng)性念珠菌病和肺曲霉病的檢測，在PC的檢測中應(yīng)用較少[15-16]。本研究結(jié)果顯示，注射地塞米松前兩組大鼠外周血和灌洗液的BDG水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。注射地塞米松8周后肺炎感染組外周血和肺灌洗液BDG水平表達均上升，均高于對照組，且肺灌洗液BDG水平高于外周血(P<0.05)。結(jié)果提示了BGD與PCP有一定相關(guān)性，可作為PCP的早期輔助診斷指標。吳歡歡等[17]也發(fā)現(xiàn)BGD與PCP具有一定相關(guān)性，是可靠的PCP輔助診斷的指標。肺灌洗液中BGD高于血清BGD，原因是肺部是PC的易感部位，且肺泡中含有大量吞噬細胞，吞噬病原菌后可釋放更多BDG[18]。

4 結(jié) 論

本研究成功建立PCP大鼠PC基因的LAMP檢測方法，可將此方法與臨床常用的PCP診斷方法結(jié)合并進行優(yōu)化，對簡捷高效的新型診斷技術(shù)開發(fā)具有一定的潛在價值。同時，本研究發(fā)現(xiàn)BGD與PCP有一定相關(guān)性，可作為PCP的早期輔助診斷指標。