復(fù)方腫節(jié)風(fēng)清咽合劑質(zhì)量標準研究

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(貴陽中醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院 藥學(xué)部,貴州 貴陽 550003)

復(fù)方腫節(jié)風(fēng)清咽合劑為貴陽中醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院院內(nèi)制劑，該制劑為耳鼻喉科臨床醫(yī)生在長期臨床實踐的基礎(chǔ)上，通過自主研發(fā)而成的中藥成方院內(nèi)制劑，經(jīng)過多年臨床觀察，療效確切，患者反映良好，并于2014年獲得醫(yī)院制劑批文( 批準文號: 黔藥制字Z20140036) 。復(fù)方腫節(jié)風(fēng)清咽合劑由腫節(jié)風(fēng)、麥冬、魚腥草、桔梗和紅花五味中藥組成，具有清熱解毒、消腫止痛、清利咽喉等功效，主要用于伴有咽喉腫痛、咽癢、咳嗽癥狀的扁桃腺炎，喉痹(急、慢性咽炎)，尤其對急性咽炎有良好的治療效果[1]。這個制劑后來在原有湯劑的工藝上進行了劑型改進，成為合劑[2]，具有使用方便、起霧效果好等特點，經(jīng)口腔黏膜超聲后，既起到局部理療的作用，又使藥液直達患處，具有抗炎、消腫止痛、清熱解毒、潤喉利咽之功效。本實驗采用薄層色譜法對處方中腫節(jié)風(fēng)、桔梗、紅花進行定性鑒別；采用高效液相色譜法測定制劑中反丁烯二酸的含量，并對測定的方法學(xué)進行了考察，結(jié)果證實檢測方法準確可靠，可用于復(fù)方腫節(jié)風(fēng)清咽合劑的質(zhì)量控制。現(xiàn)將實驗過程報道如下。

1 材料與儀器

1.1 材料

實驗試劑包括乙酸乙酯、甲醇、環(huán)己烷、甲酸、正丁醇、丙酮、三氯甲烷、乙腈(色譜純)、磷酸、雙重蒸餾水等；反丁烯二酸對照品(含量99.4%，批號：111541-201102，由中國食品藥品檢定研究院提供，用于含量測定)；硅膠G板、硅膠H板(青島海洋化工廠)；聚酰胺薄膜板(浙江省臺州市路橋四甲生化塑料廠出品)。實驗樣品由本院自制。

1.2 儀器

①Agilant 1260高效液相色譜儀(包括G1311C四元泵，G1329B自動進樣器，G1316A柱溫箱，G4212B 二極管陣列檢測器，G1329B自動進樣器，G4212B DAD檢測器， G1311C四元泵，G1316A 1260柱溫箱，LC-1260色譜工作站)；②SK5210HP型超聲波清洗器；③ESJ182-4電子天平(十萬分之一)；④98-1-B型電子調(diào)溫電熱套；⑤101-2AB電熱鼓風(fēng)干燥箱；⑥ZF-20D暗箱式紫外分析儀；⑦DZKW-4型電子恒溫水浴鍋。

2 方法及結(jié)果

2.1 薄層色譜鑒別

2.1.1 腫節(jié)風(fēng)鑒別 取本樣品15 mL，加入15 mL水稀釋，用60 mL乙酸乙酯分兩次萃取，合并乙酸乙酯萃取液，水浴蒸干，加1 mL甲醇溶解殘渣，作為供試品溶液。取缺腫節(jié)風(fēng)的陰性制劑15 mL，同法制備陰性對照液。另取腫節(jié)風(fēng)對照藥材2.0 g，濾液同供試品制備法制備對照藥材溶液。照薄層色譜法(《中國藥典》2015年版四部通則0502)試驗，吸取對照藥材溶液5 μL，其余兩種溶液各10 μL，點于同一硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷-乙酸乙酯-甲酸(8∶5∶1)的溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10 %硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱5 min，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，分別顯相同顏色的斑點，陰性對照無干擾[3]。見圖1。

2.1.2 麥冬鑒別 取本品20 mL，加10 mL水稀釋，加入0.3 g硅藻土混勻，離心15 min，取上清液加鹽酸0.9 mL，小火微沸8 min，冷卻，用20 mL三氯甲烷分2次萃取，合并三氯甲烷液，水浴蒸干，殘渣加1 mL甲醇使溶解，作為供試品溶液。取缺麥冬的陰性制劑20 mL，同法制備陰性對照液。另取麥冬對照藥材2.0 g，加甲醇20 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液水浴蒸干，加水20 mL使溶解，按照以上“加鹽酸”同法制成對照藥材溶液。照薄層色譜法(《中國藥典》2015年版四部通則0502)試驗，吸取對照藥材溶液5μL，其余兩種溶液各10～15 μL，點于同一硅膠G薄層板上，以氯仿-丙酮(8∶2)的溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點清晰，供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，分別顯相同顏色的斑點，陰性對照無干擾[3]。見圖2。

2.1.3 紅花鑒別 取本品20 mL，加30 mL水稀釋，置分液漏斗中，用50 mL正丁醇萃取，分取正丁醇層，水浴蒸干，殘渣加水50 mL使溶解，用50 mL乙酸乙酯振搖提取，棄去乙酸乙酯層；水層用50 mL正丁醇振搖萃取，取正丁醇液，水浴蒸干，殘渣加1 mL甲醇溶解，作為供試品溶液。取缺紅花的陰性制劑20 mL，同法制備陰性對照液。另取紅花對照藥材1.0 g，加80 %丙酮溶液50 mL，超聲3 0min，濾過，濾液蒸干，殘渣加1 mL甲醇使溶解，作為對照藥材溶液。照薄層色譜法(《中國藥典》2015年版四部通則0502)試驗，吸取對照藥材溶液3 μL，其余兩種溶液各5 μL點于同一聚酰胺薄膜板上，以乙酸乙酯-甲酸-水-甲醇(10∶2∶1∶0.2)的溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以1 %三氯化鋁乙醇液，熱風(fēng)吹至斑點顯色清晰，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點，陰性對照無干擾[3]。見圖3。

2.2 反丁烯二酸含量測定

2.2.1 色譜條件 色譜柱為DIKMA Diamonsil?C18(5 μm,4.6 mm×250 mm),流動相為乙腈-0.1 %磷酸溶液(2∶98)，二極管陣列波長掃描范圍：190～360 nm，柱溫：30 ℃，流速：1.0 mL/min，進樣量：10 μL。

2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取反丁烯二酸對照品9.49 mg置于25 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，得對照品貯備液于5℃冰箱保存?zhèn)溆茫芪? mL置于25 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得對照品溶液。(每1mL含反丁烯二酸30.368 μg)。

2.2.3 供試品溶液的制備 精密量取復(fù)方腫節(jié)風(fēng)清咽合劑樣品5 mL，置100 mL量瓶中，加蒸餾水至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 系統(tǒng)適用性試驗 分別取對照品溶液、供試品溶液和缺腫節(jié)風(fēng)藥材的陰性空白溶液進樣，見圖4。反丁烯二酸的保留時間為6.5 min，陰性空白色譜圖在反丁烯西二酸峰位置處無干擾峰，反丁烯二酸與其他組分分離完全(分離度>1.5)。理論板數(shù)以反丁烯二酸峰計算應(yīng)不低于6 000。

2.2.5 方法學(xué)考察 線性關(guān)系考察:精密量取反丁烯二酸對照品貯備液2 mL置50 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，制成15.184 μg/mL的對照品溶液，分別精密吸取該對照品溶液1、5、9、13、17、21、25 μL，注入液相色譜儀，以反丁烯二酸進樣量(μg)為橫坐標，峰面積A為縱坐標，繪制標準曲線，進行線性回歸計算，線性回歸方程為：Y=8 310.4X+11.999，R2=0.999 8，反丁烯二酸在0.0151 84～0.379 6 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。線性回歸曲線見圖5。

圖1 制劑中腫節(jié)風(fēng)薄層鑒別 圖2 制劑中麥冬薄層鑒別 圖3 制劑中紅花薄層鑒別

圖4 復(fù)方腫節(jié)風(fēng)清咽合劑的HPLC色譜

圖5 反丁烯二酸對照線性回歸曲線

精密度試驗：精密吸取對照品溶液(15.184μg/mL)10μL按上述色譜條件，重復(fù)進樣，結(jié)果反丁烯二酸的平均峰面積為1284.7835(n=6)；RSD為0.98%。

重復(fù)性試驗：取樣品(批號：20160601)，按“2.2.3”項下制備供試品溶液(n=6)，進樣10μL，測定峰面積，供試品中反丁烯二酸的平均含量為0.27mg/mL，RSD為0.83%，表明該方法的重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗：取重復(fù)性試驗中的第一份供試液，考察0、2、4、6、10、12h測定反丁烯二酸峰面積，結(jié)果反丁烯二酸平均含量為0.26mg/mL，RSD為1.4%，說明在12h內(nèi)供試液穩(wěn)定性良好。

回收率試驗：精密吸取已知反丁烯二酸含量的復(fù)方腫節(jié)風(fēng)清咽合劑樣品(批號：20160601 反丁烯二酸含量0.271 42mg/mL)2mL，置100mL量瓶中，加入反丁烯二酸對照品溶液(0.303 5mg/mL)2mL，按供試品溶液的制備方法制備，進樣10μL，測定，計算回收率。回收率實驗結(jié)果見表1。

表1 復(fù)方腫節(jié)風(fēng)清咽合劑中反丁烯二酸回收率試驗結(jié)果

2.2.6 樣品測定 按上述供試品溶液制備，并按上述色譜條件測定8批復(fù)方腫節(jié)風(fēng)清咽合劑中反丁烯二酸的含量，按外標法計算峰面積。測定結(jié)果見表2。

3 結(jié)語

通過本實驗研究，經(jīng)過多種提取方法和展開系統(tǒng)的考察，最終確定對該制劑的質(zhì)量控制除腫節(jié)風(fēng)、紅花、麥冬可以定性鑒別外，在對應(yīng)的色譜中相應(yīng)的位置上，其余藥材均有陰性干擾，因此未能列入質(zhì)量標準草案中[4，5]；在反丁烯二酸定量方法建立時，分別采用了不同溶劑及不同時間下以直接稀釋法或超聲法制備供試品溶液，以水作為溶劑直接稀釋法制備樣品時反丁烯二酸含量較高且方法簡便；同時還分別考察了乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸溶液的不同比例色譜條件，結(jié)果以乙腈-0.1%磷酸溶液(2∶98)時分離度及峰型均較好，并通過回收率實驗驗證了本方法準確可靠。反丁烯二酸的平均含量為0.2775mg/mL ，從大批量規(guī)模生產(chǎn)考慮，本品每毫升含反丁烯二酸的量，其限度以80%計算，換算成每瓶含(100mL/瓶)反丁烯二酸(C4H4O4)計，不得少于22mg。通過HPLC-DAD方法學(xué)的考察，證實該方法簡便易操作，準確度較高，可作為復(fù)方腫節(jié)風(fēng)清咽合劑的質(zhì)量控制標準。

表2 八批樣品含量測定結(jié)果 (n=2)