龍膽草總酚含量測定和自由基清除活性研究

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(1.廣西中醫藥大學 藥學院，廣西 南寧530001；2.南寧師范大學 化學與材料科學學院，廣西 南寧 530001)

研究表明，帕金森癥等眾多疾病與人體內自由基失衡有關，因此，尋找具有良好自由基清除能力的天然抗氧化劑成為研究的熱點之一[1，2]。龍膽草(Gentianarigescens)是龍膽科龍膽屬植物，多年生草本，高30～60cm；根莖平臥或直立，短縮或長達5cm，具粗壯、略肉質的須根；花枝單生，直立，黃綠色或紫紅色，中空，近圓形，具條棱，棱上具乳突，稀光滑。龍膽草具有清熱燥濕、瀉肝定驚的功效，可用于治療濕熱黃疸、小便淋痛、陰腫陰癢、濕熱帶下、肝膽實火之頭脹頭痛、目赤腫痛、耳聾耳腫、脅痛口苦、熱病驚風抽搐等病證[3]。目前，對于龍膽草的抗氧化能力未見報道。本研究采用不同溶劑對龍膽草進行提取，得到龍膽草的乙醇、丙酮和乙酸乙酯提取物，并測定其提取物的總酚含量和自由基清除能力。

1 材料與儀器

UV1901型紫外可見分光光度計(北京普析電子科技有限公司)；地膚子從廣西玉林藥材市場購買；沒食子酸標準品從百靈威試劑公司(北京)購買。

2 方法

2.1 龍膽草不同溶劑提取物的制備

將龍膽草剪碎后打成粉末，取20 g龍膽草粉末放入圓底燒瓶，分別加入200 mL乙醇、丙酮及乙酸乙酯。冷浸72 h后將提取液倒出，加入新的溶劑，重復浸泡3次。將提取液合并后用旋轉蒸發儀將溶劑回收，得到龍膽草的乙醇、丙酮及乙酸乙酯提取物。

2.2 ABTS·+自由基清除能力測定[4]

將50 mL的2 mM的2,2'-聯氨-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺鹽(ABTS)溶液與200 mL K2S2O8水溶液(70 mM)混合，搖勻后避光12～16 h得到ABTS·+溶液，并用磷酸鹽緩沖液將其稀釋至73 nm處，吸光度為(0.70±0.02)。取一定量提取物溶液，加入1.9 mLABTS·+溶液，在不同時間點測其吸光度并計算提取物對ABTS·+自由基清除率。

2.3 總酚含量測定

2.3.1 Folin-Ciocalteu試劑的配制 在圓底燒瓶中裝入80 g鎢酸鈉和20 g鉬酸鈉，加入 560 mL蒸餾水，溶解后加入40 mL磷酸溶液(85%)和80 mL濃鹽酸，回流10 h后加入12 g硫酸鋰及60 mL雙氧水，加熱沸騰15min至溶液呈亮黃色，冷卻后定容至1 000 mL。

2.3.2 提取液中總酚含量的測定 將龍膽草提取物溶液分別加入1 mL Folin-Ciocalteau試劑，混合均勻。加入3 mL 2 % Na2CO3溶液后用蒸餾水定容到10 mL，2 h后測量溶液在760 nm處的吸光度。提取液中總酚含量根據回歸方程計算。

3 結果

3.1 不同濃度提取物對ABTS·+自由基清除能力的影響

龍膽草乙醇提取物對ABTS·+自由基的清除能力如圖1所示。可見，隨著提取物濃度增加，乙醇提取物對ABTS·+自由基的清除能力增強。在作用時間為5 min時，濃度為0.5 mg/mL的乙醇提取物對ABTS·+自由基的清除率為17.7 %，當濃度增加到1.0 mg/mL時清除率增大到25.5 %。同時，EE對ABTS·+自由基的清除能力與作用時間有關。對于濃度為1.8 mg/mL的乙醇提取物，1 min時對ABTS·+自由基的清除率為38.6 %，當作用時間增加到10 min，其對ABTS·+自由基的清除率增加到58.8 %。

圖2顯示不同濃度龍膽草丙酮提取物對ABTS·+自由基的清除能力。丙酮提取物的ABTS·+自由基清除效果隨不同提取物濃度和作用時間的變化規律與乙醇提取物相似。隨著提取物濃度和作用時間增加，丙酮提取物對ABTS·+自由基的清除能力增加。作用時間為5 min時，提取物濃度為0.5和0.8 mg/mL的丙酮提取物對自由基清除率分別為15.9 %和26.2 %，濃度為1.5 mg/mL和1.8 mg/mL時清除率分別為39.4 %和46.9 %，當濃度增加為2.0 mg/mL時清除率達到71.1 %。對于濃度為1.8 mg/mL的丙酮提取物，其對ABTS·+自由基的清除能力從1 min時的52.4 %迅速增加到10 min時的66.7 %。

3.2 不同溶劑提取物對ABTS·+自由基清除率的比較

龍膽草不同溶劑提取物在10 min時對ABTS·+自由基清除能力如圖3所示。在最低濃度0.5 mg/mL時，丙酮提取物的清除率為17.0 %，乙醇提取物和乙酸乙酯提取物的清除率分別為20.2 %和22.8 %。在1.0 mg/mL時，乙醇提取物、乙酸乙酯提取物和丙酮提取物對ABTS·+自由基清除率分別為31.9 %、35.8 %和32.5 %。在最高濃度2.0 mg/mL時，丙酮提取物表現出最強的清除能力，其對ABTS·+自由基清除率為77.0 %。

3.3 不同溶劑提取物總酚含量測定結果

龍膽草乙醇提取物、乙酸乙酯提取物和丙酮提取物的總酚含量分別為31.3 mg/g、21.9 mg/g和30.2 mg/g。三種提取物都具有較高的總酚含量，其優良的自由基清除效果可能與其含有的酚類成分有關。

圖1 龍膽草乙醇提取物對ABTS·+自由基的清除能力

圖2 龍膽草丙酮提取物對ABTS·+自由基的清除能力

圖3 龍膽草溶劑提取物對ABTS·+自由基的清除能力

提取物EC50(mg/mL) 乙醇提取物1.41乙酸乙酯提取物1.70丙酮提取物1.53

4 結論

在本研究中，我們用不同溶劑對龍膽草進行提取，得到龍膽草的乙醇、丙酮和乙酸乙酯提取物，通過測定其提取物的總酚含量和自由基清除能力。結果表明，龍膽草三種溶劑提取物都表現出良好的自由基清除能力，其對ABTS·+自由基的EC50值在1.41～1.70 mg/mL范圍內，表明三種溶劑提取物對這類自由基均表現出良好的清除效果。隨著濃度和時間的增加，提取物對ABTS·+自由基的清除能力增強，表明三種提取物優良的自由基清除效果可能與其含有的酚類成分有關。