利用PCR擴增快速篩選天麻萌發真菌小菇屬Mycena sp.的研究*

楊志平 ，秦麗媛 ，王玉川 ，陳 林 ，3，4，楊明摯 ，張漢波 ，4**

（1.云南大學生命科學學院，云南 昆明 650091；2.昭通市天麻研究院，云南 昭通 657000；3.云南大學生態與環境科學學院，云南 昆明 650091；4.云南大學省部共建云南生物資源保護與利用國家重點實驗室，云南 昆明 650091）

天麻（Gastrodia elata） 是高度退化的蘭科多年生、腐生草本植物，全株無綠葉，無葉綠素，不能進行光合作用，地下有肉質塊莖，長扁形，大小不一。其種子如粉塵般細小，無胚乳和其他營養貯備部位，僅由胚和種皮構成，胚組織無器官分化，在沒有可供給種子萌發的外源營養條件下，其正常發芽需依靠小菇屬（Mycenasp.）為主要類群的真菌促進。目前已經確定了部分天麻利用萌發菌，完成自身萌發的相關代謝通路及抗性相關基因和蛋白的表達[1]。天麻種子利用紫萁小菇（M.osmundicola） 獲得養分的方式為種子的原胚體細胞消化、吸收菌絲使胚體長大突破種皮發芽[2]。

在實際的應用和研究工作中，小菇屬真菌分離過程中存在一定的困難，除了剛萌發的原球莖，很難直接判斷其他材料上是否存在萌發菌，這一問題限制了一些有可能存在萌發菌的材料的發掘，進而導致某些萌發菌的物種很難被人們發現并利用。云南省昭通市一直以來就有麻農用蕨草須根來促進天麻種子萌發，但這種方法會造成很大程度的空塘率。之后麻農從山東、北京、陜西等省市引入“兩菌”，部分新的引入種確實能提高產量，但也存在引入菌種退化、不純等問題，這不僅未能促進當地天麻產業的發展，還帶來眾多問題，例如感染有雜菌、病毒、害蟲的兩菌會引發天麻塊莖腐爛病和蟲蝕等。同時市面上的萌發菌，大多來源不明確，菌株與大多數食用菌菌落形態相似，真假難辨，甚至有不良商家用食用菌充當萌發菌進行銷售，造成部分種植戶的重大經濟損失。

因此，快速定位天麻萌發菌在“環境”中的存在，對于找到并分離天麻萌發菌非常有意義。雖然近幾年出現的高通量測序方法也可以快速檢測出樣本中是否存在小菇屬真菌，但此方法用于檢測大量樣本將導致較高的經濟成本和時間成本。所以本試驗根據MacDonald&Sarre提出的適用于設計檢測“環境DNA”中某種物種的引物的驗證框架[3]，并結合運用Primer Premier 5.0進行引物設計的方法[4]，設計適用于小菇屬真菌DNA快速檢測的特異性引物。這種用“環境DNA”樣品檢測目標DNA存在的方法提供了一個定位小菇屬真菌相對簡單、快速而又經濟的方法。為研究、分離更多小菇屬真菌奠定良好的前期基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

本研究所用的小菇屬真菌菌株（Mycenasp.）BZZ由昭通市天麻研究院提供。用于檢驗設計引物的特異性試驗所用菌株囊括了子囊菌門（Ascomycota）、擔子菌門（Basidiomycota）、接合菌 （Zygomycota） 門三個門的黑盤孢科 （Amphisphaeriaceae）、梨孢假殼科 （Apiosporaceae）、葡萄座腔菌科（Botryosphaeriaceae）、殼斗科 （Capdiaceae）、革蓋菌科（Coriolaceae）、新球腔菌科（Davidiellaceae）、間座殼科（Diaporthaceae）等45個科，擬盤多毛孢屬（Pestalotiopsis）、葡萄座腔菌屬 （Botryosphaeria）、枝孢屬（Cladosporium）、炭疽菌屬（Colletotrichum）、附球（真） 菌屬（Epicoccum）、偽壺擔菌屬（Pseudolagarobasidium）、柄銹菌屬 （Puccinia） 等 125個屬，合計125種真菌。

1.1.2 主要試劑和儀器

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（potato dextrose agar，PDA）：去皮馬鈴薯100 g，切成小塊，加水煮沸30 min，用4層紗布過濾，在濾液中加葡萄糖10 g、瓊脂10 g，加去離子水補足至500 mL。

5×TBE：Tris 堿 54 g、 硼 酸 27.5 g、0.5 mol·L-1EDTA-Na 20 mL，用800 mL無菌去離子水溶解，混勻后加無菌去離子水用容量瓶定容至1 L（pH為8.0）。dNTP Mix（大連 TaKaRa公司），Ex Taq酶（大連TaKaRa公司），DL2000 DNA Marker（大連TaKaRa公司），Golden view核酸染料、TIANGEN TIANamp Soil DNA Kit土壤基因組DNA提取試劑盒、TIANGEN Plant Gemic DNA Kit植物基因組DNA提取試劑盒。

土壤篩、分析天平，Model CPA26P，德國；Gering組織細胞破碎儀TissuePrep，北京中創先鋒科技有限責任公司；VeritiTM梯度PCR儀，Applied Biosystems，美國；核酸電泳儀，Bio-Rad，美國；紫外凝膠成像分析系統，Bio-Rad，美國。

1.2 方法

1.2.1 引物設計

在 NCBI（National Center for Biotechnology Information） 網站上查詢、下載小菇屬和口蘑科（Tricholomataceae）其他屬真菌的部分基因序列，如表1所示。接著將序列導入DNASTAR Lasergene v7.1軟件包中的SeqMan中，然后將所有序列合并為一個FASTA格式文件。使用軟件Clustal X v2.1將序列文件的多個序列進行兩兩比對構建距離矩陣[5]，觀察距離矩陣找出小菇屬序列中一致的，但不同于同科中其他屬真菌序列的區域，記下位點和此位點的序列區。使用MrBa v3.2構建系統發育樹[6]。使用jModel－Test v2.1.4選擇最適合的核苷酸取代模型[7-8]。結合找出的位點和區域，選取與小菇屬真菌相近但與其他屬真菌較遠的序列，用Primer Premier v5.0進行引物設計。

表1 設計引物用序列信息Tab.1 Information of downloaded sequences from NCBI used for design primers

1.2.2 引物特異性檢測

在進行引物驗證前，采用實驗室現有小菇屬真菌菌株BZ的DNA作為陽性對照測試引物，測試能否成功擴增出小菇屬真菌序列。成功擴增出小菇屬真菌序列后，采用實驗室其他種屬的真菌DNA驗證引物特異性。驗證時首先利用引物合成公司給的退火溫度擴增DNA序列。若特異性差（出現非特異性條帶）可適當提高退火溫度；若目標條帶太暗，可適當增加DNA濃度或增加擴增反應循環數；若非特異性條帶出現在100 bp～200 bp區間，則應該考慮降低引物濃度。

1.2.3 引物實際運用靈敏度檢測

在昆明西山森林公園采集林下土壤，采用60目土壤篩過篩后，收集土壤分裝在20支離心管中，每管裝2.5 g，進行土壤濕熱滅菌，3次滅菌完成后待用，滅菌條件為121℃，60 min，每次滅菌后取出于室溫放置24 h再進行下一次滅菌；在貼有玻璃紙的PDA培養基上接種陽性小菇屬真菌菌株BZZ，待其長滿培養基后，用無菌9 mm菌落打孔器打孔截出圓菌片，再用無菌鑷子將圓菌片取50片置于滅菌且裝有濾紙的培養皿中（在放入圓菌片前先稱量此培養皿重量并記下數值），裝完后稱量總重量；將單個圓菌片面積分別為1/8、1/4、1/2和1個、5個、10個圓菌片在無菌操作條件下加入上述準備好的離心管中，接著將離心管置于快速組織細胞破碎儀中研磨，直至圓菌片與土壤進行充分混勻。接下來，按TIANamp Soil DNA Kit的提取方法進行總DNA提??；先用通用引物ITS（ITS4：TCCTCCGCT TATTGATATGC； ITS5： GGAAGTAAAAGTCGTAA CAAGG）[13]擴增驗證DNA提取質量，再用篩選出的特異引物和擴增條件進行擴增。

引物靈敏度定義為圓菌片質量占土壤質量的百分比（土壤質量遠遠大于菌盤重量），其數值越小，說明該引物靈敏度越高。計算公式（S，%）為：

注：m1表示圓菌片質量（g）；m2表示土壤質量（g）。

1.2.4 PCR擴增

反應體系：10×擴增緩沖液5μL，dNTP混合物5μL，正反引物各1μL，DNA模板1μL，Taq DNA聚合酶0.25μL，加雙蒸水至50μL。擴增條件：94℃變性4 min；94℃反應 1 min；適當退火溫度（X） 反應1 min；72℃反應1 min，35個循環。72℃延伸10 min。其中退火溫度（X）根據各對引物退火溫度調整。

1.2.5 瓊脂糖凝膠電泳檢測

制備1%的瓊脂糖凝膠。將加熱溶解的膠體稍稍冷卻至50℃～60℃后加入DNA顯色劑（0.05%Golden view）混勻，倒入插好梳子的膠槽，完全冷卻后拔下孔梳，把膠置于盛有1×TBE緩沖液的電泳槽備用。

吸取PCR產物5μL與1μL 6×Loading Buffer混勻后點入點樣孔，以DL2000的DNA Marker為參照，在121 V恒壓下電泳30 min。電泳結束后，將膠塊在紫外凝膠成像系統中拍照觀察。

1.2.6 實際檢測能力驗證

采用采自昭通小草壩的天麻種子萌發菌塘土壤和天麻原球莖驗證所設計引物的實際檢測能力。將天麻原球菌用無菌水沖洗3次，按照TIANGEN Plant Gemic DNA Kit的方法提取總DNA。采集的土壤經60目土壤篩篩選，采用TIANamp Soil DNA Kit提取總DNA。利用篩選出來的引物對這些環境樣本總DNA進行PCR擴增，擴增DNA片段送生工生物工程（上海）股份有限公司測序，檢驗能否從樣本中快速檢測出小菇屬真菌。

2 結果與分析

2.1 ITS基因引物設計

共設計了5對引物，引物位置見圖1，引物信息見表2。

圖1 設計引物位置圖Fig.1 Position diagram of designed primers in this study

2.2 PCR擴增陽性驗證

PCR擴增陽性驗證結果見圖2。

由圖2可知，所有引物都成功擴增出實驗室小菇屬真菌BZZ的DNA片段，PCR產物的實際大小均在設計理論片段大小范圍內，且測序后比對結果均為小菇屬真菌，說明所有引物均能擴增實驗室的小菇屬真菌序列。

2.3 真菌菌株DNA的PCR擴增特異性驗證

通過分析3個門、45個科、125個屬的125株真菌的PCR擴增結果可知，M52-1特異性不強，測試菌株均能擴增出條帶；M52-2在退火溫度為63℃時，除陽性外被擴增出來的菌株還有肉座菌科（Hypocreaceae） 的臍孢木霉菌（Trichoderma brevicompactum）、Gmoniaceae科的Ophiogmonia apiospora、小叢殼科 （Glomerellaceae） 的小叢殼屬真菌（Glomerellasp.），占到測試菌株的2.4%；M22-3在退火溫度為61℃時，除陽性外被擴增出來的菌株還有新球腔菌科 （Davidiellaceae） 的枝孢菌 （Cladosporiumsp.）、黑盤孢科（Amphisphaeriaceae）的擬盤多毛孢（Pestalotiopsis neglecta）、小雙腔菌科（Didymellaceae） 的巨腔莖點霉（Phoma macrostoma）、小叢殼科 （Glomerellaceae） 的膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）、黑腐皮殼科 （Valsaceae）的擬莖點霉（Phomopsissp.）、格孢腔菌科（Pleosporaceae） 的甘蔗雙孔孢菌（Bipolaris sacchari）、炭角菌科（Xylariaceae）的座堅殼菌（Roselliniasp.）、叢赤殼科（Nectriaceae）的水生鐮孢（Fusicolla aquaeductuum），占到測試菌株的6.4%；M11-4在退火溫度為58℃時，除陽性外被擴增出來的菌株還有炭角菌科（Xylariaceae） 的中碳墊菌屬菌（Nemaniasp.）、叢赤殼科（Nectriaceae）的瑪利亞霉（Mariannaeasp.）、口蘑科（Tricholomataceae）的杯傘屬菌（Clitocybesp.）、隔孢球殼科（Didymosphaeriaceae） 的Paraphaeosphaeria neglecta、蛇形蟲草科 （Ophiocordycipitaceae） 的Chaupycnissp.，占到測試菌株的4.0%；BZZ-5在退火溫度為63℃時，除陽性外被擴增出來的菌株還有發菌科（Trichocomaceae）的青霉菌（Penicilliumsp.）、傘形霉科（Umbelopsidaceae）的傘狀霉屬菌（Umbelopsissp.）、莢孢腔菌科 （Sporormiaceae） 的光黑殼屬菌（Preussiasp.）、葡萄座腔菌科（Botryosphaeriaceae）的小新殼梭孢（Neofusicoccum parvum）、炭角菌科（Xylariaceae） 的Xylaria venustula、小叢殼科（Glomerellaceae） 的博寧炭疽菌（Colletotrichum boninense）、叢赤殼科 （Nectriaceae） 的燕麥鐮刀菌（Fusarium avenaceum）、肉座菌科 （Hypocreaceae）的枝頂孢霉屬菌（Acremoniumsp.）、小叢殼科（Glomerellaceae） 的朱頂紅炭疽菌 （Colletotrichum cliviae），占到測試菌株的7.2%。

表2 設計引物信息Tab.2 Information of designed primers in this study

圖2 PCR擴增陽性驗證膠圖Fig.2 Electrophoretic gel for PCR amplification as positive control

2.4 土壤中的小姑屬真菌DNA擴增靈敏度驗證

土壤中的小姑屬真菌DNA擴增靈敏度驗證結果見圖3和圖4。

圖3 各個濃度土壤總DNA經ITS引物擴增的PCR產物膠圖Fig.3 Electrophoretic gel for PCR amplification of different concentrations of Mycena sp.DNA in soil by ITSprimer

由圖3和圖4的引物ITS4和ITS5檢驗可知，試驗成功提取了按比例加過菌絲的土壤總DNA，目標片段出現在750 bp指示帶附近，符合理論長度即700 bp左右，如圖3所示。用特異性良好的4對引物，即M22-3、BZZ-5、M52-2和M11-4，進行靈敏度驗證后，結果如圖4所示。通過膠圖，可以看出M22-3、BZZ-5靈敏度較好，在測試范圍內能檢測到的菌絲最小濃度為0.033%，而根據其條帶的亮度，M22-3靈敏度最好；M52-2、M11-4靈敏度相較于其他兩對較差，在測試范圍內能檢測到的最小濃度為1.292%。

2.5 實際土壤環境和生物組織檢測能力驗證

用4對均成功來自天麻原球莖和天麻種子萌發菌塘土壤樣本的引物的總DNA擴增出相應片段，大部分片段測序峰圖良好，少數幾條片段為雙重峰。擴增片段經過序列測定，在NCBI上經BLAST比對，發現特異DNA片段序列與分離自日本的日本赤箭（Gastrodia nipponica）的小菇屬真菌菌株序列（Gen－Bank accession number：LC013373） 相似度都達到了99%。結果表明引物M22-3、BZZ-5、M52-2和M11-4都能夠從環境樣本DNA中快速檢測出小菇屬真菌，但M52-2和M11-4的DNA擴增片段測序時部分樣本會出現雜峰。

圖4 四對引物靈敏度檢測膠圖Fig.4 Electrophoretic gel of four pairs prumers.in the test of primer sensitivity

3 討論

1980年徐錦堂和冉硯珠[14]從天麻種子發芽的原球莖中首次分離出與天麻種子具有共生作用的“京陜807-02號”，該菌株后來被鑒定為紫萁小菇[15]。隨后陸續有一些新的萌發菌的相關報道，如蘭小菇（M.orchidicola）、石斛小菇（M.dendrobii）、開唇蘭小菇（M.aectochili）等[16]。盡管汪鋆植等[17]發現來自白栓菌屬的大白栓菌（Trametes laclinea） 為一種新的萌發菌；Liu等[18]表明來自其他4個屬的真菌，包括毛殼菌屬 （Chaetomium）、瘤菌根菌屬 （Epulorhiza）、頭孢霉屬（Cephalosporium）、角菌根菌屬（Ceratorhiza）也可以促進天麻萌發。但這些菌株主要處于研究階段，并未實際運用到天麻的種植生產中。相對來說，小姑屬真菌仍然是目前最為有效和廣泛地用于人工栽培天麻的萌發真菌類群[19-20]。利用小菇屬真菌作為萌發菌，天麻種子發芽率高、營養繁殖莖和原球莖生長速度快、體積大，接上蜜環菌的幾率高，天麻產量也高[21]。因此鑒定、篩選出優良的小菇屬真菌，對提高天麻有性繁殖產量至關重要。

本試驗針對現階段昭通當地的天麻種植過程中萌發菌菌種退化、菌種資源單一等問題開展研究。通過對目前已經在NCBI登記的小菇屬真菌DNA序列的歸納、總結，在ITS序列區間內設計并得到了4對小菇屬真菌特異性良好的引物（M52-2、M22-3、M11-4和BZZ-5），均可以成功擴增出小菇屬真菌。然而，設計引物時未能夠找到完全擴增不出其他屬真菌的引物，某些被擴增出的其他屬真菌在分離測序菌株中的占比分別為木霉屬（Trichodermasp.）0.8%、枝孢屬（Cladosporiumsp.）0.8%、擬盤多毛孢屬（Pestalotiopsissp.）5.3%、炭疽菌屬（Colletotrichumsp.）0.8%、碳墊菌屬（Nemaniasp.）1.5%、瑪利亞霉（Mariannaeasp.）3.0%、青霉菌（Penicilliumsp.）3.0%、傘狀霉屬（Umbelopsissp.）0.8%、鐮刀菌屬（Fusariumsp.）13.5%。不過，在測試菌株內檢測引物特異性時，4對引物能擴增出來的其他屬真菌幾乎不重疊，故在實際運用時可采用2對到多對引物同時進行擴增；當采用土壤作為檢測的“環境”樣本進行引物靈敏度檢測時，土壤中含有0.033%的菌絲體濃度時即可成功檢測出小菇屬真菌的存在；同時，用天麻萌發初期組織和菌塘土壤樣本總DNA檢測了引物在實際生產中運用能力，有4對引物都可以檢測出小菇屬真菌的分布?？傮w來看，本文設計獲取的M22-3和BZZ-5兩對引物對小菇屬真菌的特異性、靈敏度都較高，經過組合應用，能夠達到快速篩選出小菇屬真菌的目的，并可用于對環境材料中小菇屬真菌的快速定位。

除天麻外，大多數蘭科植物的種子萌發和幼苗生長也依賴小菇屬Mycenasp.等真菌營養[22-23]。本研究利用設計的ITS引物進行PCR擴增快速篩選天麻萌發真菌的結果，也可為其他蘭科植物種子萌發真菌的篩選提供借鑒，從而促進蘭科植物種苗快繁途徑中有性繁殖技術的發展。