金針菇蛛網病病原菌鑒定*

蘭玉菲，叢倩倩，崔 曉

（泰安市農業科學研究院，山東 泰安 271000）

金針菇[Flammulina velutipes（Fr.）Singer]是我國重要的栽培食用菌之一，其營養豐富、味道鮮美，尤其富含賴氨酸和精氨酸，被稱為“益智菇”[1-2]，深受人們喜愛。

近年來隨著金針菇種植規模的逐年增大，蛛網病發生和危害呈加重趨勢，已成為金針菇生產中污染嚴重的真菌病害之一。在工廠化周年栽培廠房內和農戶菇棚中子實體的發育時期均可發生。該病一旦發生，蔓延迅速，毀滅性強，同時會產生大量孢子，給金針菇種植企業和菇農帶來巨大的經濟損失。為了明確引起該病害的病原，筆者對病原菌進行了分離和鑒定，明確了病原菌的分類地位，以期為該病害的科學防治提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 病原菌采集

發病樣品采自濟寧市金鄉縣金針菇菇棚內。

1.2 病原菌的分離純化

無菌環境下，將采集的感病子實體的病健交界處組織接種于PDA培養基（涂布有2滴～3滴25%乳酸）上，黑暗培養。菌絲萌發后進行3次純化得到純培養，編號為JN，4℃冰箱保存備用。

1.3 致病性測定

將JN菌株活化培養10 d～12 d后，用無菌水制備孢子懸浮液（每毫升1×106），采用噴霧法接種，定期觀察發病情況。從接種發病的金針菇上重新分離病原菌，確定是否為同一病原菌。以無菌水噴灑到健康子實體為對照[3-4]。

1.4 形態學鑒定

觀察并記錄病原菌在PDA培養基上的菌落特征、菌落顏色變化等。顯微觀察菌絲特征和分支情況，孢子形態和大小等并拍照。

1.5 分子生物學鑒定

制備病原菌菌絲體并提取其基因組總DNA，具體方法參照文獻[5]；利用ITS1/ITS4真菌ITS區域擴增的通用引物[6]進行PCR擴增，PCR反應體系和程序參照文獻 [5]；將PCR產物測序后所得到的DNA序列輸入GenBank進行Blast檢索，利用DNAMAN、MEGA等軟件對該病原菌ITS序列與GenBank中收錄分離物的ITS序列進行比較和分析，構建系統進化樹。

2 結果與分析

2.1 癥狀特征

病原菌對金針菇子實體的為害癥狀見圖1。

圖1 病原菌對金針菇子實體的為害癥狀Fig.1 Symptom of cobweb disease on Flammulina velutipes fruiting bodies

病害癥狀如圖1A和圖1B，主要癥狀表現為在金針菇催蕾期，菇蕾上出現肉眼可見的白色絮狀物，隨著子實體的生長發育，白色絮狀物將整個子實體覆蓋住，并產生大量的分生孢子，最后導致子實體倒伏、腐爛。

2.2 病原菌致病性測定

試驗結果表明，分離的病原菌接種到健康金針菇子實體上發病后的癥狀（圖1C和圖1D） 與栽培條件下采集的病害樣品癥狀完全一致（圖1A和圖1B）；而對照組子實體未表現出病害癥狀。從人工接種發病的金針菇子實體上再次分離得到病原菌，且性狀與接種物相同。證明菌株JN為金針菇蛛網病的病原菌。

2.3 病原菌分離和形態特征觀察

菌株JN的菌落和形態特征見圖2。

圖2 菌株JN的菌落和形態特征Fig.2 Colony and morphology of JN strain

菌株JN在PDA培養基上初期菌絲潔白濃密，菌落邊緣整齊，后期有粉狀分生孢子產生；菌絲培養后期不產生色素，菌落背面無色（圖2A～2C）。病原菌絲為有隔菌絲，在菌絲上形成分生孢子梗，分生孢子梗分枝并輪生，在小梗頂端形成分生孢子，分生孢子呈橢圓形，單細胞或雙細胞，大小為（12.4～16.8）μm× （6.4～8.6）μm，無色透明 （圖 2D）。

2.4 病原菌ITS的序列測定與分析

用于構建系統發育樹的相關Hypomyces屬菌株和ITS序列以及構建的NJ系統發育樹分別見表1和圖3。

以病原菌總DNA為模板，PCR擴增后得到長度約為600 bp的目的片段。測序結果表明擴增產物長度為574 bp（GenBank登錄號為MH607599），其中包括18S rDNA基因序列21 bp、內轉錄間隔區1（ITS1） 176 bp、5.8S編碼序列157 bp、內轉錄間隔區 2（ITS2）200 bp和 28S rDNA 20 bp。經與 Gen-Bank中相關基因序列（表1） 進行同源性比對，菌株JN與GenBank中引起韓國斑玉蕈蛛網病的病原Hypomyces aurantius（AB591044） 同源性最高，核苷酸一致率為99.81%。進一步構建系統進化樹發現菌株J N與GenBank中來自于不同國家的H.aurantius的6個分離物聚為一簇，組內核苷酸一致率為98.26%～99.81%，而與枝葡孢屬（Cladobotryum） 其他種 （Cladobotryum dendroides、Cladobotryum mycophilum和Cladobotryum semicirculare） 的核苷酸一致率為87.72%～90.61%（如圖3所示）。結合形態特征，將JN菌株鑒定為金黃菌寄生H.aurantius（無性型Cladobotryum varium）。

表1 用于構建系統發育樹的相關Hypomyces屬菌株和ITS序列登錄號Tab.1 Related strains of Hypomyces used in phylogenetic analysis and their ITSsequence accession number

圖3 基于ITS序列構建的NJ系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree based on ITSsequences and constructed using the neighbor-joining method

3 討論

菌寄生屬（Hypomyces） 建立于1860年，隸屬于子囊菌門 （Ascomycota） 糞殼菌綱 （Sordariomycetes） 肉座菌目 （Hypocreales） 肉座菌科（Hypocreaceae），該屬真菌具有重寄生性，通常生長于多孔菌、牛肝菌、傘菌和盤菌等真菌的子實體上，無性階段主要包括枝葡孢屬（CladobotryumNees）、瘤孢屬（SepedoniumLink）、疣孢霉屬（MycogoneLink） 等[7-8]。

本研究對山東省金針菇病害的病原學進行了研究，通過分子鑒定并結合形態特征，證明該病害為金針菇蛛網病，病原為金黃菌寄生菌Hypomyces aurantius（Pers.）Fuckel（無性型：Cladobotryum variumNees）。

在我國Teng[9]首次報道了該病菌；蔡為明等[10]報道Cladobotryum varium引起金針菇軟腐病；張琪輝等[11]報道該病菌引起斑玉蕈蛛網病并造成嚴重損失；Chang等[4，12]報道在韓國雙孢蘑菇和斑玉蕈工廠中也發現了該病菌。蛛網病是由Cladobotryum屬/Hypomyces屬真菌侵染引起的食用菌病害，該病可危害多種食用菌，在歐洲、美洲和亞洲等地區均有報道[11]，筆者首次在中國發現Cladobotryum mycophilum引起雙孢蘑菇蛛網病，并對其生物學特性、發生特點和防控技術進行了研究[13-15]。本研究首次利用分子生物學手段對山東省金針菇蛛網病病原進行了鑒定，明確了其病原，為該病害的防治奠定理論基礎。關于金針菇蛛網病病原菌的生物學特性、發生特點和防控技術還有待于進一步研究。