細菌類可直接飼用微生物在反芻動物上的應用及可能作用機制

■付文娟 王 慶梅曉明 王香萍 馬艷華

（山東鶴來生物科技有限公司，山東濰坊 262605）

動物用益生菌是一類能通過改善胃腸道微生態平衡而對宿主動物產生有益影響的活的微生物，早在上世紀20年代就有在養殖動物中應用的相關報道。因益生菌或益生素定義寬泛，且容易和人用相關產品相混淆，美國食品藥品管理局（FDA）和美國飼料協會（AAFCO）要求飼料生產企業統一使用可直接飼用微生物（DFM）這一概念。DFM比益生菌的定義范圍要狹窄，FDA進一步將DFM定義為“活的，天然微生物”，目前在動物用益生菌相關研究論文中使用DFM這一概念的越來越普遍。由于抗生素等多種添加劑的禁用與限用及養殖中生態理念的深入，DFM在畜牧和水產中的應用越來越廣泛。反芻動物因其瘤胃微生物消化的特性，在選擇應用DFM菌種時與單胃動物有著明顯的區別，此外養殖階段、養殖條件、動物品種及使用目的等諸多因素也會影響DFM的使用效果。

1925年就有關于酵母菌在泌乳奶牛上應用的首篇報道，從20世紀50年代開始，酵母菌在反芻動物上應用的報道就不斷增加，Renz和Koch發現每天飼喂50 g酵母培養物就能增加產奶量。經過近幾十年的發展，酵母菌在反芻動物上的應用效果研究也已相對成熟，相關研究報道和綜述較多。而關于細菌DFM在反芻動物上的應用起步相對較晚，近年來隨著人們對細菌DFM的日益關注，相關試驗報道也在不斷增加，但針對細菌DFM在反芻動物上應用效果及作用機制的綜述還相對較少，本文就細菌DFM對不同養殖階段反芻動物生產性能和健康的影響進行了總結，并對可能的作用機制進行了探討。

1 細菌DFM在幼齡反芻動物上的應用

在現代集約化養殖環境下，新生幼齡反芻動物一般在消化道微生物完全定植之前就已經和母畜分開，并需要面臨一系列如斷奶、接種疫苗等應激，因此易出現腹瀉等問題，造成幼齡反芻動物早期發病和死亡，給反芻動物養殖帶來巨大的經濟損失。從現有研究報道看，應用細菌DFM有助于幼齡反芻動物減少腹瀉并促進其生長發育。

從20世紀80年代開始就有關于乳酸菌在新生或應激幼齡反芻動物上應用的報道，在該階段微生物群落正處于過渡敏感期，飼料或環境的突然改變可引起胃腸道微生物群落的改變，這個階段飼喂乳酸菌主要是為了維持正常的腸道菌群。在幼齡反芻動物中常用的乳酸菌有乳桿菌、腸球菌、鏈球菌和雙歧桿菌。大部分試驗結果表明在幼齡反芻動物上使用乳酸菌對其生長有促進作用的，Signorini M L等[1]對15個試驗的數據進行薈萃分析發現在犢牛飼糧中添加乳酸菌能降低腹瀉率，Frizzo L S等[2]分別對36個和26個試驗的數據進行薈萃分析，結果表明添加乳酸菌能提高犢牛體增重并改善飼料轉化率。劉國仕[3]發現乳酸菌制劑能顯著提高羔羊平均日增重，提高飼料報酬。當然也有少量研究表明乳酸菌的添加對反芻動物沒有顯示出效果，Abu-tarboush H M等[4]發現給犢牛飼喂乳酸菌，其飼料轉化率沒有變化。

近10年來關于芽孢桿菌在反芻動物上應用效果的研究越來越多，主要集中在枯草和地衣芽孢桿菌。就現有文獻來看，芽孢桿菌在幼齡反芻動物上的應用效果大部分都是正面的，張海濤等[5]發現納豆枯草芽孢桿菌能促進荷斯坦犢牛瘤胃發育。符運勤[6]認為地衣芽孢桿菌可促進0～8周犢牛的平均日增重。郭云霞等[7]證實在斷奶羔羊精料中添加枯草芽孢桿菌能顯著提高飼料消化率和生長性能并降低腹瀉率，崔一喆等[8-9]在離乳馬鹿和離乳梅花鹿中也得到了類似的結果。也有試驗表明芽孢桿菌對犢牛生長性能的改善沒有效果，Riddell J B等[10]發現飼喂枯草和地衣芽孢桿菌對犢牛的干物質采食量、平均日增重和飼料轉化率均沒有改善作用。

2 細菌DFM在奶用反芻動物上的應用

對于高產奶用反芻動物而言，泌乳早期是使用細菌DFM的最佳時期，因為此階段反芻動物一般處于能量負平衡，而且飼喂的一般是高精料飼糧容易引起瘤胃酸中毒[11]。在奶用反芻動物上使用較多的細菌DFM主要有乳酸菌、丙酸桿菌和納豆枯草芽孢桿菌，埃氏巨型球菌也有少量應用。綜合現有文獻來看，細菌DFM對奶用反芻動物產奶量的影響大部分是正效應，而對奶組分的影響并不一致。Jaquette R D等[12]發現給泌乳奶牛飼喂嗜酸乳桿菌可將產奶量提高1.8 kg/d，干物質采食量、乳脂肪和乳蛋白含量不受影響。Lehlpenya K V[13]的研究表明，給泌乳奶牛飼喂丙酸桿菌，產奶量、干物質校正乳和4%脂肪校正乳分別提高2.7、0.9 kg/d和1.6 kg/d。West J W等[14]發現，在泌乳奶牛飼糧中同時添加嗜酸乳桿菌和丙酸桿菌，產奶量增加6.96%。Raeth-knight M L等[15]進行了相似的試驗，但是DFM對奶牛產奶量、干物質采食量、飼糧消化率和瘤胃發酵沒有發現影響。Peng H等[16]向36頭泌乳奶牛飼糧中添加不同劑量的納豆枯草芽孢桿菌，飼喂9周后發現納豆枯草芽孢桿菌的添加對干物質采食量無影響，但能提高產奶量和飼料轉化率（P＜0.05），對乳脂率和乳蛋白產量無影響，但增加了乳脂產量（P＜0.05）和乳糖含量（P＜0.01）。

3 細菌DFM在肉用反芻動物上的應用

研究表明在肉用反芻動物中添加細菌DFM能提高其飼料轉化率和日增重，并對胴體品質有一定的改善效果，不過這些益生效果并不總是一致的。在肉用反芻動物上應用較多的細菌DFM有乳酸菌和丙酸桿菌，芽孢桿菌和埃氏巨型球菌也有部分應用。Krehbiel C R等[17]通過對多個試驗的數據結果進行總結發現，在肉牛飼糧中添加不同比例的嗜酸乳桿菌+丙酸桿菌可將日增重提高2.5%～5%，飼料轉化率改善近2%，胴體質量一般能增加6～7 kg，采食量數據不一致。張曉勇[18]發現在綿羊飼糧中添加植物乳桿菌可顯著提高其采食量和營養物質消化率。Brashears M M等[19]在肉牛飼糧中添加嗜酸乳桿菌NPC747，結果表明體增重、采食量和肉料比與對照組沒有區別。Elam N A等[20]發現在育肥肉牛日糧中添加嗜酸乳桿菌和費氏丙酸桿菌對其生產性能和胴體品質沒有任何影響。劉國仕[3]發現枯草芽孢桿菌能顯著提高羔羊日增重，并提高羔羊的屠宰率（胴體重、凈肉重和骨重）。賈鵬等[21]發現在杜寒雜交肉羊飼糧中添加地衣芽孢桿菌對其采食量、體增重沒有顯著性影響，不過能顯著降低料重比。

4 細菌DFM在反芻動物上可能的作用機制

綜上可知反芻動物對細菌DFM會有各種不同的應答，某些外在因素如菌種的選擇、動物的生理狀態、基礎飼糧的類型、飼養管理水平等因素都會影響細菌DFM的使用效果，但內在的作用機制是其能否起作用的關鍵，因此非常有必要探究其中所涉及的潛在機制。

4.1 對瘤胃和腸道發育的影響

Zhang H T等[22]發現給斷奶后犢牛飼喂納豆枯草芽孢桿菌處理組瘤胃乳頭密度和乳頭表面積高于對照組，瘤胃上皮發育好于對照；在其另一篇報道中發現犢牛飼喂納豆枯草芽孢桿菌后，其小腸的長度、盲腸和結腸的重量均大于對照組，從而可能使得犢牛體內纖維得到了更好的消化。賈鵬等[21]發現在杜寒雜交肉羊飼糧中添加地衣芽孢桿菌能顯著提高瘤胃和小腸重量。由此說明芽孢桿菌可能能促進瘤胃上皮及腸道的發育。張海濤等[23]認為納豆枯草芽孢桿菌對瘤胃發育的促進作用可能與瘤胃上皮細胞對丙酸、丁酸等揮發性脂肪酸的吸收增加有關。而腸道的發育也可能與短鏈脂肪酸有關，王麗鳳[24]發現乳酸菌能促進腸道菌群增殖，腸道微生物經發酵產生的短鏈脂肪酸能通過提供給腸黏膜能量，改善組織局部供血，進而促進腸上皮細胞的修復以及提高胰液中胰酶的分泌來促進腸道的發育。此外細菌DFM對瘤胃發育的影響可能也與瘤胃菌群的建立有關。Yu P等[25]發現添加納豆枯草芽孢桿菌改變了斷奶后瘤胃細菌群落結構，能促進犢牛瘤胃微生物區系的建立，促進纖維降解菌的定植和生長，處理組中主要的纖維分解菌16SrDNA拷貝數是對照組的3倍。

4.2 對瘤胃發酵的影響

4.2.1 影響瘤胃pH值

瘤胃液pH值的穩定對于維持反芻動物瘤胃內環境的穩態及瘤胃微生物的生長起著關鍵的作用。瘤胃pH值的下降引起乳酸在瘤胃內的積累，影響瘤胃內微生物的生長，導致瘤胃內微生物菌群失調，容易誘發瘤胃酸中毒，影響瘤胃壁的完整性及動物健康。目前反芻動物養殖過程中大部分使用的是高精料飼糧，易引起瘤胃酸中毒，而使用細菌DFM被證明是目前緩解瘤胃酸中毒的有效手段之一。

埃氏巨型球菌是瘤胃中主要的乳酸鹽利用菌，能同時利用乳酸鹽、葡萄糖和麥芽糖，并與乳酸鹽產生菌競爭底物，可通過有效利用瘤胃內的乳酸鹽來維持瘤胃pH值：Greening R C等[26]報道當給肉牛飼喂高精料飼糧時，瘤胃會積聚大量的乳酸鹽，巨型埃氏球菌通過快速利用乳酸鹽可防止pH值急劇下降或急性酸中毒的發生。丙酸桿菌雖然在瘤胃內以產丙酸鹽為主要任務，但也可作為瘤胃內的乳酸鹽利用菌：Gilchrist M J等[27]報道綿羊在適應高精料飼糧時，丙酸桿菌對乳酸鹽的利用能占到總量的40%～50%。還有研究表明丙酸桿菌也能通過促進原蟲的生長（尤其是內毛蟲），降低瘤胃中淀粉分解菌的數量，對穩定瘤胃pH值起到一定的功效。此外乳酸菌對于維持瘤胃pH值的穩定，緩解瘤胃酸中毒可能也有一定的有益影響，Van Koevering M T等[28]表明飼喂嗜酸乳桿菌能降低肉牛瘤胃中D-乳酸鹽和總乳酸鹽的濃度。Huffman R P等[29]發現在誘導發生亞急性酸中毒的公肉牛飼糧中添加嗜酸乳桿菌能降低瘤胃pH值在6以下的時間。Yoon I K等[30]表明這種益生作用可能與乳酸菌能使瘤胃微生物快速適應乳酸的存在，并促進乳酸鹽利用菌的增殖有關，具體機制還有待進一步的研究。關于芽孢桿菌降低瘤胃pH值的報道不太一致，大部分研究表明芽孢桿菌對降低瘤胃pH值沒有效果。4.2.2 影響揮發性脂肪酸的產量

研究表明在反芻動物飼糧中添加細菌DFM可提高揮發性脂肪酸濃度，但對各種揮發性脂肪酸濃度提高效果不一樣。Sun P等[31]在奶牛日糧中添加納豆枯草芽孢桿菌固體發酵物后，丙酸、戊酸及總揮發性脂肪酸產量顯著升高，乙酸及乙酸/丙酸顯著降低。鄧露芳[32]研究表明反芻動物日糧中添加納豆枯草芽孢桿菌后，乙酸、丙酸和總揮發性脂肪酸濃度分別提高了10.43%、50.35%和20.70%（P＜0.05）。其在體外人工瘤胃發酵試驗中發現，納豆枯草芽孢桿菌處理組揮發性脂肪酸各指標均有不同程度的提高，乙酸、丙酸、丁酸和揮發性脂肪酸總量分別提高6.52%、1.96%、11.02%和5.77%（P＜0.05）。揮發性脂肪酸濃度的增加可能因為芽孢桿菌通過自身分泌的胞外酶或者通過增加瘤胃細菌的數量提高了飼料消化利用率。Hosoi T等[33]表明芽孢桿菌能分泌復雜的纖維素酶、淀粉酶等胞外酶系，可促進營養物的消化吸收。Deng L F和鄧露芳[32，34]在奶牛飼糧中添加納豆枯草芽孢桿菌可增加纖維分解菌（溶纖維丁酸弧菌、黃色瘤胃球菌和白色瘤胃球菌和淀粉分解菌（牛鏈球菌和嗜淀粉瘤胃桿菌）數量，普雷沃氏菌數量也顯著提高。

瘤胃中碳水化合物發酵的主要產物是乙酸、丙酸、丁酸等揮發性脂肪酸，它們是反芻動物主要的能量來源及合成乳脂肪和體脂肪的原料，因此揮發性脂肪酸的濃度將會直接影響泌乳奶牛產奶量及乳成分產量。除了影響產奶量和乳成分，在前面已經提到反芻動物瘤胃和腸道的發育可能也與產生的揮發性脂肪酸有關。此外張海濤等[23]也發現芽孢桿菌也可能通過影響瘤胃中揮發性脂肪酸的產量改變瘤胃滲透壓最終促進犢牛的采食量，而Baile C A等[35]提出瘤胃壁的丙酸受體有調控采食量的功能，Oba M等[36]和Weiss W P等[37]發現在瘤胃灌注丙酸及飼喂丙酸菌增加了瘤胃內丙酸進而降低了采食量，Allen M S等[38]發現增加的丙酸濃度對采食量的影響與體內葡萄糖需求相關。

4.2.3 影響氨態氮濃度

瘤胃中氨態氮是反應瘤胃代謝水平的重要指標，通過測定瘤胃中氨態氮濃度可間接反應瘤胃微生物分解飼料粗蛋白產生氨氮和利用氨氮合成微生物蛋白的平衡情況，其濃度與日糧降解氮對微生物氮的轉化效率呈負相關。目前有關細菌DFM對瘤胃氨態氮濃度的研究資料比較匱乏，而且研究結果也不太一致。喬國華等[39]發現地衣芽孢桿菌能夠降低瘤胃內氨態氮濃度，通過增加瘤胃內細菌數可提高瘤胃微生物對氨的利用，而枯草芽孢桿菌則沒有這種效果。鄧露芳[32]和Sun[31]都發現用納豆枯草芽孢桿菌飼喂奶牛時，瘤胃液中氨態氮濃度增加，氨態氮濃度增加可能與瘤胃內原蟲數量提高有關，瘤胃原蟲對細菌的吞食作用是降低瘤胃微生物蛋白合成的重要因素。Ghorbani G R等[40]在奶牛日糧中添加丙酸桿菌，瘤胃內原蟲數量增加，加速了瘤胃內細菌的氮循環，提高了瘤胃中氨氮濃度。就現有研究資料來看，菌種的選擇對瘤胃氮代謝的影響較大，具體機制還有待進一步研究。

4.2.4 影響甲烷產量

對反芻動物而言，甲烷菌通過種間氫轉移產生甲烷來維持瘤胃中正常的氫分壓，使微生物對底物的發酵順利進行，從而保證反芻動物對營養物質的有效吸收和利用，但與此同時反芻動物因瘤胃甲烷的產生而損失的能量可達到飼料總能的2%～15%，極大幅度降低了反芻動物的飼料利用率。目前有關通過添加細菌DFM來控制甲烷產生的報道相對較少，肖怡[41]發現添加地衣芽孢桿菌可在一定程度上降低肉羊的甲烷排放量，通過實時定量PCR對試驗羊瘤胃中的甲烷菌進行絕對定量發現可能因為直接減少了甲烷菌和原蟲的數目，從而減少甲烷排放量。喬國華等[39]發現在反芻動物飼糧中添加地衣芽孢桿菌可顯著降低甲烷產量，但是枯草芽孢桿菌和蠟樣芽胞桿菌組則差異不顯著，地衣芽孢桿菌組甲烷產量的降低可能因為甲烷菌的生長受到了抑制。Ellis J L等[42]在奶牛日糧中添加乳酸菌，結果表明當日糧的底物不同時，對奶牛甲烷的產量各不相同。由此可見使用的菌種和飼糧類型對甲烷產量都有影響。此外研究發現甲烷的產量可能還與瘤胃中揮發性脂肪酸濃度及比例有關，甲烷的生成量與乙酸比例呈正相關，與丙酸比例呈負相關，當瘤胃發酵產生乙酸/丙酸為0.5時，不產生甲烷，當發酵全部生成乙酸時，以甲烷形式損失的能量約為33%[43]。Ghorbani G R等[40]發現反芻動物飼糧中添加的丙酸桿菌能夠降低甲烷產量，對于改善能量利用率有一定的效果，可能因為丙酸桿菌的添加促進了瘤胃內丙酸鹽的產生，降低了乙酸/丙酸比例。

4.2.5 腸道菌群與機體免疫

經過瘤胃進入小腸內的細菌也會對腸道內的菌群產生有益影響，Tabe E S J等[44]發現在育肥牛飼糧中添加嗜酸乳桿菌能將糞便中脫落的E.coliO157∶H7降低32%。Brashears M M等[19]發現添加乳酸菌能降低肉牛糞便中脫落的E.coliO157∶H7并減少對牛皮的污染。Hosoi T等[33]發現納豆枯草芽孢桿菌能促進乳酸桿菌的生長和活性，Osawa R[45]、賈力敏[46]、陳兵等[47]證實納豆枯草芽孢桿菌能抑制致病菌生長。納豆枯草芽孢桿菌的抑菌特性可能與其分泌產生的抗菌素桿菌肽，多粘菌素和2,6-吡啶二羧酸有關。乳酸菌對腸道菌群產生的有益影響可能與以下兩個機制有關[48-49]：①乳酸菌可在腸道形成生物屏障，競爭性排除病原菌；②乳酸菌能產生對病原體具有拮抗作用的化學物如有機酸，過氧化氫，小分子抑菌化合物（羅伊菌素）和抗菌肽（細菌素）等。有關細菌對反芻動物免疫功能的影響相對較少，梁晉瓊等[50]發現枯草芽孢桿菌活菌制劑具有治療犢牛和生產奶牛細菌性腸道疾病的作用，同時具有治療和預防羔羊細菌性腸道疾病的作用。Sun P等[51]的研究表明奶牛日糧中添加納豆枯草芽孢桿菌，能顯著增加IgG和細胞因子IFN-γ的分泌，有利于激活免疫系統，提高機體免疫力。楊華等[52]發現在肉羊飼糧中添加芽孢桿菌和雙歧桿菌可顯著性提高脾臟指數、IgG和IL-6含量，有利于提高肉羊的免疫功能。Roos T B等[53]發現蠟樣芽胞桿菌能提高綿羊體液免疫。

5 結語

細菌DFM對不同養殖階段反芻動物的生產性能和健康均具有顯著的改善效果，作為一種天然綠色的飼料添加劑，細菌DFM在反芻動物養殖上將會有廣闊的應用前景，但在實際生產中細菌DFM的選用應綜合考慮反芻動物的飼糧類型、飼糧處理方式、動物生長階段、動物生理狀況等，在使用細菌DFM時也應充分考慮菌種種類、組合方式、添加劑量等。目前關于細菌DFM對反芻動物瘤胃的影響機制資料較少，在將來的研究中，尚需進一步揭示細菌DFM與瘤胃發育、瘤胃營養物質消化率、瘤胃微生物菌群平衡、瘤胃能量代謝等方面的相互作用；針對細菌DFM對瘤胃后胃腸道作用機制方面的研究，目前已有的數據主要是針對體外細胞或在其他動物上的研究結果，因此有必要開展與反芻動物相關的腸道有害菌群及動物免疫方面的工作；以上研究對于深入了解細菌DFM的作用機制，開發新的對反芻動物更有效的細菌DFM產品具有重要的理論指導意義。