外泌體與糖尿病腎病相關研究的最新進展

胡 燕

糖尿病腎?。―N）是一種嚴重的微血管并發癥，常與1型和2型糖尿病相關，是腎功能衰竭的主要原因，也是發達國家終末期腎?。‥SRD）的主要原因之一［1］。DN是由葡萄糖代謝紊亂引起的腎小球毛細血管和管狀結構功能改變引起的進行性腎臟疾病。腎小管間質纖維化（ECM）被認為是糖尿病腎病進展的主要決定因素。盡管過去幾十年已經在診斷和治療DN患者方面取得了重大進展，但仍未能顯著降低這一人群的病死率，迫切需要尋找早期發現、早期診斷和早期治療DN的生物標志物。近幾年有關外泌體在腎臟疾病中的研究越來越多，外泌體是由細胞產生并存在于體液中的細胞外囊泡（EV）［2］。 外泌體含有多種生物分子，例如脂質，蛋白質，miRNA和mRNA，現已證明外泌體通過在細胞間轉移核酸、蛋白質、脂質等特定組成從而在細胞間通訊中發揮著關鍵作用，并參與多種腎臟疾病的發生發展。

1 外泌體的起源及生物學特性

外泌體是由大多數細胞分泌的直徑40～100 nm的細胞外囊泡，特別是免疫系統細胞，如巨噬細胞［3］，B 細胞［4］和 T 細胞［5］，以及間充質干細胞［6］，內皮細胞［7］和上皮細胞［8］。 研究證明多種癌細胞也可分泌外泌體［9］。它們可以在多種類型的細胞外液中發現，如血液，尿液，羊水，唾液，腦脊液，甚至母乳［10-13］。

外泌體由不同的生物分子組成，包括DNA、RNA、蛋白質、脂質。在透射電子顯微鏡下，外泌體是由脂質雙分子層組成的呈杯型的囊泡。所有外泌體都含有膜轉運和融合蛋白（GTPases，膜聯蛋白，flotillin），tetraspannins（CD9，CD63，CD81，CD82），熱休克蛋白（Hsc70，Hsp90），參與多泡體生物發生的蛋白質（Alix，TSG101），以及脂質相關蛋白和磷脂酶。由于不同細胞來源的外泌體其蛋白質有一定差異，目前最廣泛使用的“外泌體標志物”包括四種跨膜蛋白（Alix，flotillin，TSG101 和 Rab5b）。 除了蛋白質外，外泌體還富含脂質，如膽固醇（主要是B淋巴細胞），神經酰胺（與外來體分離溶酶體有關），以及具有長飽和脂肪?；湹牧姿岣视王ィ?4，15］。Batista等［16］也發現外泌體表面富含甘露糖、聚乳糖胺、α-2，6唾液酸和復雜的N-連接聚糖等糖集團。外泌體還含有細胞因子、轉錄因子受體、生長因子受體和其他生物活性分子。研究提示，信號通過三種方法從外泌體轉移到受體細胞：受體-配體相互作用，直接膜融合和內吞作用/吞噬作用。迄今為止，分離外泌體多種方法可用，包括超速離心、蔗糖梯度超速離心結合超濾離心 （SGUUC）、磁性激活細胞分選（MACS）和商業試劑盒。根據實驗要求，可以使用不同的方法分離外泌體［17］。

2 外泌體在糖尿病腎病中的研究進展

DN是終末期腎衰竭的主要原因，與其他導致腎病的原因相比，其與糖尿病發病率和病死率增加有關。白蛋白尿通常是DN的第一個臨床指標。然而，微量白蛋白尿具有一定的局限性：首先，它不能用于DN的病因診斷，因為它只是內皮損傷的標志物；其次，它與腎臟損害的類型和數量無關；最后，它不是DN的必要條件：事實上，已知一些糖尿病患者在沒有出現白蛋白尿的情況下惡化為腎功能衰竭。除白蛋白之外的其他蛋白質已確定為DN的診斷標志物，如，β2微球蛋白（β2MG）和泛素。但這些蛋白質也有局限性：β2MG是腎小管損傷的標志物，直到現在還沒有研究比較糖尿病和非糖尿病腎病患者的尿β2MG排泄。泛素作為診斷標志物也因為尿液水平與DN組織學分類之間缺乏相關性而受到限制。白蛋白尿或蛋白尿是患有各種腎病的患者的常見癥狀，因此，仍作為診斷DN的特定生物標志物。

尿液是腎臟疾病生物標志物的理想來源，如尿液mRNA分析已作為發現生物標志物的工具。然而，尿中的mRNA通常來自凋亡或壞死細胞，很容易被尿RNase降解，幾乎沒有代表性的轉錄譜。但尿液中的外泌體攜帶的RNA可以傳遞到遠處的靶細胞，是細胞間通訊的重要途徑，與尿游離RNA不同，外泌體核酸以明顯穩定的形式存在，因為受微泡保護免受內源性RNase活性的影響。此外，它們來自所有腎單位的活細胞，有可能為腎臟病理生理學提供有價值線索。Zubiri等［18］通過對DN和健康對照者的尿外泌體進行差異定量分析，首次鑒定了352種與人類尿液外泌體相關的蛋白質，并發現三種蛋白質（AMBP，MLL3和 VDAC1）在 DN 中的變化，為改善DN的早期診斷、預測DN的進展，以及監測DN對治療的反應開辟了一個新的研究領域。Jiang等［19］也提出了可將外泌體用于治療DN的研究，將人尿液干細胞中提取的外泌體（USCs-Exo）靜脈注射到Ⅰ型糖尿病大鼠，由于外泌體很少足細胞凋亡因而能改善Ⅰ型糖尿病大鼠的腎損傷，這可能與人尿液干細胞（USCs）中潛在的細胞因子VEGF、TGF-β1、血管生成素和BMP-7有關。USCs-Exo的應用有望成為治療DN的新方法。當然這需要進一步研究關于足細胞或內皮細胞外泌體作用的機制和途徑。

2.1 DN診斷方面外泌體WT1的水平與尿蛋白-肌酐比，白蛋白-肌酐比和血清肌酐的顯著增加以及eGFR的下降相關。此外，與尿液WT1陰性患者相比，WT1陽性的患者腎功能降低。ROC曲線分析顯示WT-1能有效預測eGFR<60 ml/min·1.73 m2患者。WT1蛋白主要在糖尿病患者的尿外泌體中存在，而且其表達水平隨著腎功能的下降而增加，表明它可以用作糖尿病腎病的早期非侵入性標志物［20］。最新研究［21］表明尿外泌體WT1可預測未來幾年eGFR的下降，因而可作為改善DN患者危險分層的有用生物標志物。Zubiri等［22］對大鼠尿外泌體分析發現，與健康動物相比，糖尿病大鼠的尿外泌體中的Regucalcin蛋白減少，從而反映病理組織的變化，但這需要進一步的前瞻性研究，評估疾病進展和治療過程中regucalcin的水平變化，揭示regucalcin與白蛋白尿，eGFR和生物標志物變化的相關性并評估regucalcin與其他傳統或新型生物標志物相比或與之相結合的預測潛力，從而進行更精確的疾病分期和治療的個體化。總之，DN腎組織中regucalcin蛋白表達明顯降低，在糖尿病腎病患者尿分離的外泌體中有所表現，故尿外泌體regucalcin可作為探索糖尿病腎病的早期診斷和進展監測的新工具。Mohan等［23］證實了在糖尿病進展期糖尿病大鼠尿液外泌體中miR-451-5p和miR-16水平逐漸升高，但在糖尿病大鼠腎臟中均減少，腎組織miR-451-5p和miR-16表達（10周時）與尿液水平無相關性，與腎臟病理指標呈負相關。從而提出糖尿病患者腎miR-451-5p和miR-16的相對升高對糖尿病引起的腎纖維化有保護作用，而UE miR-451-5p作為腎臟疾病的早期、敏感的非侵襲性指標，可能具有預后價值，但有待進一步研究確定miR-451-5p作為一種非侵入性工具連續監測糖尿病腎損傷的潛力。 有研究［24，25］報道尿外泌體中 miR-29c 的水平可反映腎功能和組織學纖維化程度，而作為腎纖維化的新型非侵入性標志物。Krishnamurthy等［26］通過連續離心將尿外來體與全尿分離，并通過ELISA測量血漿銅藍蛋白，發現糖尿病腎病患者的尿外泌體中明膠酶活性降低和血漿銅藍蛋白水平升高與腎組織中這兩種蛋白質的改變一致，而全尿中這兩種蛋白質的水平變化很大，并且與糖尿病腎組織中的表達水平無關，尿液外泌體中的蛋白質標志物比全尿樣本能更好地反映腎臟中潛在的蛋白質變化，因此尿液外泌體用于糖尿病腎病的診斷和監測疾病進展似乎是一種有潛力的方法。最近［27］有人對健康對照、Ⅱ型糖尿病和Ⅱ型糖尿病腎病患者的尿液外泌體進行分析，發現Ⅱ型糖尿病腎病患者尿外泌體衍生的let-7c-5p在DN患者的尿外泌體中顯著上調（P<0.05），并且與腎小球濾過率（P<0.001）和DN的進展相關，其預測DN的AUC為0.81，也可作為DN的一種潛在生物標志物。

2.2 在糖尿病腎病機制研究方面腎纖維化是各種慢性腎病的標志，TGF-β是腎纖維化的關鍵介質［28］。腎小球內皮細胞（GEC）和腎小球系膜細胞（GMC）之間的相互作用是糖尿病腎?。―N）的重要方面。研究證明，與正常葡萄糖（NG）處理的GEC相比，高糖（HG）處理的GEC分泌更多數量的高度富集 TGF-β1mRNA的外泌體，并通過 TGF-β1/Smad3信號傳導途徑促進GMC中的α-平滑肌肌動蛋白表達，細胞增殖和細胞外基質蛋白過量產生，從而促進腎纖維化［29］。Delic 等［30］首次證明了Ⅱ型DN患者的尿外來體中miRNA譜的改變，他們使用qRT-PCR方法發現miRNA miR-320c和miR-6068在DN患者的尿外泌體中顯著上調，其中miRNA miR-320c通過靶向血小板反應蛋白1（TSP-1）可能對TGF-β信號傳導途徑產生影響從而促進DN的病情進展，并且上調的miR-320c可誘導BMP6的下調和TSP-4表達抑制，進一步加速腎纖維化過程，為DN的病理機制提供了新的見解。Ebrahim等［31］進行大鼠體外實驗研究了外泌體對DN的腎保護機制，他們發現間充質干細胞（MSC）衍生的外泌體可以抑制糖尿病大鼠腎臟體內mTOR信號通路，加強自噬調節能力來改善腎功能，從而在糖尿病腎病進程中起到保護腎臟的作用。 這些發現也為將來使用外泌體作為DN的新生物治療方法提供了基礎。

2.3 在糖尿病腎病治療方面Jiang等［19］提出了可將外泌體用于治療DN的研究。在Nagaishi等［32］的研究中認為骨髓間充質干細胞分泌的外泌體攜帶的mRNA或miRNA在腎小管上皮細胞的保護和再生中起作用，其機制主要是通過抑制TEC中TGF-β過度表達和DN中管周上皮纖維化，從而保護腎小管上皮細胞免于凋亡，并保護緊密連接結構，因此MSC-CM中包含的外泌體可能是骨髓間充質干細胞的治療效果的關鍵因素。最近Nagaishi等［33］也發現臍帶提取物含有富含外泌體，從臍帶提取物純化的外泌體可能是一系列細胞活化因子，可以增強糖尿病腎病患者骨髓間充質干細胞增殖并改善其修復功能，以及抑制內質網應激改善糖尿病腎損傷。預想，臍帶提取物或許可以提高骨髓間充質干細胞自體細胞移植的治療效果。

綜上所述，外泌體是一種存在于多種體液中，功能多樣且容易提取的小分子囊泡，在細胞間傳遞信息，是細胞間通訊的重要途徑，與糖尿病腎病的發生、診斷、預后密切相關，有希望成為檢測糖尿病腎病的新型標志物，并且已有用于糖尿病腎病治療的研究。在糖尿病腎病診斷及治療中的機制仍須進一步研究。