細胞自噬在膀胱癌發病、治療中的作用研究進展

馮相鑫，夏成興，王海峰，楊德林

(昆明醫科大學第二附屬醫院，昆明 650101)

細胞自噬是一種高度進化保守的分解代謝活動，能夠將受損老化細胞器包裹在特殊的膜結構中形成自噬體，并送入溶酶體降解。細胞自噬持續存在并遍及人體全身細胞。根據細胞受到代謝壓力的大小，自噬可分為基礎自噬和誘導自噬兩種。健康狀況下，自噬處于基礎水平，對細胞的正常內環境起到監視作用；當細胞處于低氧、藥物作用或射線等應激環境下，自噬水平將顯著提高，分解代謝活動加強以適應細胞新的能量需求狀態。自噬在細胞的動態平衡等過程中扮演重要角色。自噬異常與惡性腫瘤、帕金森病等神經退行性病變、克羅恩病等炎癥性病變、腎小球硬化癥及白內障等疾病的發生發展密切相關。細胞自噬有三種途徑：①在沒有自噬泡的形成的條件下，溶酶體直接內化并降解受損細胞器的過程稱為微自噬；②分子伴侶先與靶蛋白結合，之后轉運到溶酶體中降解的過程稱為分子伴侶介導的自噬；③細胞內形成的錯誤蛋白或受損細胞器先被特殊的雙層膜結構包裹之后再與溶酶體融合，進而將待降解底物送入溶酶體進行降解的過程稱為巨自噬，降解后產生的的小分子物質又以合成新的蛋白質或產生能量的方式被機體利用。巨自噬是現階段關于細胞自噬研究的焦點。在生理條件下，當細胞內產生錯誤折疊的蛋白質、活性氧和受損的線粒體時，適當水平的自噬能夠發揮清除作用，避免因代謝應激增加引起的DNA損傷，進而提前抑制了腫瘤的發生。在腫瘤形成后，自噬能促進腫瘤細胞的存活，其主要機制是腫瘤細胞通過利用自噬產生的能量加強了在低氧和低營養狀態下的生存能力。 自噬水平降低和自噬誘導在腫瘤的形成、發展階段發揮重要作用。但目前對細胞自噬的認識還不夠全面和成熟，精確檢測細胞自噬的方法也正在探索和完善之中，研究方法差異及研究腫瘤對象的不同常常使得研究者們對自噬所扮演的角色得出不同的結論。現將細胞自噬在膀胱癌發病、治療中的作用進展綜述如下。

1 細胞自噬在膀胱癌發病中的作用

1.1 細胞自噬在膀胱癌細胞增殖中的作用 根據腫瘤所處微環境的不同，自噬發揮著抑制和促進的雙重作用，在腫瘤發生的初始階段自噬主要起抑制腫瘤發生的作用，在晚期則主要促進腫瘤的發展[1]。自噬基因Beclin1是一種重要的抑癌基因，Beclin1表觀遺傳學改變與腫瘤的發生發展密切相關[2]。研究[3]發現，乳腺癌、胃癌等癌細胞中存在Beclin1基因異常甲基化，同時伴有Beclin1 mRNA及蛋白質表達水平降低，進一步研究發現，在胸腺癌細胞系中過表達 Beclin1可抑制癌細胞的生長。 自噬是正常細胞的一種生理功能，對腫瘤的發生具有抑制作用。實體瘤組織中密集的癌細胞對氧氣和營養物質需求更加迫切。應激狀態下，腫瘤細胞可利用自噬降解產生物質和能量增強自身對抗苛刻內環境的能力，抑制癌細胞的凋亡[4]。 Beclin1是自噬體形成過程的一個必須分子，它能夠介導其它參與自噬體形成的蛋白與吞噬泡結合，從而調控哺乳動物細胞中自噬體的生成和發展。 Beclin1在腫瘤從無到有的生成以及進一步的成熟過程中發揮重要作用，是一個重要的抑制癌癥發生的基因[5]，一方面， Beclin1依賴于 Beclin1- PI3 KC3復合體促進吞噬泡的聚集與組裝而參與自噬體的形成，另一方面， Beclin1與其他相關蛋白共同作用而調節自噬體的成熟。有學者[6]證明，Beclin 1在BTCC組織中表達下調，并且 Beclin 1高表達與患者5年生存率的提高相關。

Sivridis等[5]研究發現，高分級膀胱癌患者腫瘤組織中的自噬囊泡明顯多于低分級患者，低分級患者腫瘤組織中的自噬囊又明顯多于良性前列腺增生患者；高分級膀胱癌患者腫瘤組織自噬誘導標志物微管相關蛋白輕鏈3-Ⅰ(LC3-Ⅰ)向LC3-Ⅱ的轉變水平明顯高于低分級患者及良性前列腺增生患者。高、低分級膀胱癌患者的腫瘤組織中與自噬體初始形成階段相關的關鍵蛋白Beclin-1 、Atg7相對表達量增加。當癌組織暴露于自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3 MA)中并處于同等的饑餓狀態下，高分級膀胱癌腫瘤組織細胞凋亡數明顯多于低分級膀胱癌組織，說明高分級膀胱癌組織自噬活性高。

Lin等[6]比較了人膀胱癌細胞系RT-4 、5637與膀胱上皮永生細胞SV-HUC-1的自噬活性后發現，與SV-HUC-1比較，RT-4 、5637細胞中自噬潮更活躍；進一步研究發現，自噬抑制劑Baf A1或自噬相關基因ATG-7、ATG-12的敲除可促進膀胱癌細胞的凋亡，說明自噬在膀胱癌細胞的生存、增殖中發揮積極作用。

1.2 自噬在膀胱癌細胞凋亡中的作用 正常生理狀態下，小分子物質能夠自由通過細胞的線粒體外膜，但凋亡等特殊狀態刺激下，細胞線粒體外膜通透性增大，內膜和外膜間隙內與凋亡相關蛋白，如 CytC、核酸內切酶、凋亡抑制蛋白、 線粒體蛋白Smac/ DIABLO、凋亡誘導因子、 熱休克蛋白60(Hsp60)、 Hsp10及核苷酸激酶等，可釋放進入胞質， Cyt與 apaf-1結合并聚集成凋亡體，然后 procaspase-9被凋亡體募集后變成成熟的casepase-9。成熟的casepase-9進一步激活效應caspase-3，裂解PARP、活化核酸內切酶同時破壞細胞內的多種蛋白，最終導致細胞凋亡。Ojha等[7]在研究中發現，自噬抑制劑可導致膀胱癌細胞凋亡細胞數增多，為進一步探討引起癌細胞死亡的機制，他們分別測量了不同處理后的普通尿路上皮細胞和膀胱癌細胞中 casepase-8、casepase-9活性，結果發現饑餓處理后的膀胱癌細胞casepase-9活性增加，自噬抑制劑Wm/3-MA處理對casepase-9的活性沒有進一步的影響；單獨饑餓處理后無法在膀胱癌細胞中檢測到casepase-9活性，但加入自噬抑制劑后可檢測到casepase-9活性升高。在外源性凋亡中， Procasepase-8與死亡誘導信號復合體(DISC)結合后， 經同源活化形成的 casepase-8，無論是在未經處理的還是經過饑餓處理或自噬抑制劑處理后的正常尿路上皮細胞和膀胱癌細胞中均未檢測到；內源性凋亡以線粒體通透性和CytC釋放入胞質為特征，他們還檢測了不同處理下細胞膜電位的改變以及CytC的釋放，得到的結果同樣支持自噬抑制劑通過內源性凋亡引起癌細胞凋亡。以上研究均說明，細胞自噬水平增強可能通過抑制細胞內源性凋亡抑制膀胱癌細胞凋亡。

2 細胞自噬在膀胱癌治療中的作用

非肌層浸潤性膀胱癌(NMIBC)占初發膀胱腫瘤的70%，目前NMIBC 的治療主要采用經尿道膀胱癌電切術( TUR-BT) 配合術后膀胱灌注化療，TUR-BT既是NMIBC的重要診斷方法，同時也是主要的治療手段，膀胱灌注的目的是防止腫瘤復發、延緩疾病進展。目前膀胱癌的復發率很高，10%～30%的膀胱癌患者可能進展為浸潤性膀胱癌(MIBC)[9]。過去20年內，MIBC的五年生存率基本沒有變化。新輔助鉑類化療(NAC)在膀胱癌根治術前的應用提高了非轉移性 MIBC患者7%的五年生存率[10]，但目前膀胱癌的病死率沒有發生很大的改變。因此，新治療方法的產生或現有治療方法有效率的提高將有利于膀胱癌患者的治療結果。近年來，自噬抑制劑作為輔助藥物聯合化學療法治療尿路上皮癌得到了進一步的研究和認可，但膀胱癌細胞在治療過程中容易發生耐藥，嚴重影響患者預后。最新研究[11]表明，膀胱上皮癌干細胞暴露于吉西他濱和絲裂霉素中培養后，細胞自噬活性升高、糖酵解基因高表達、抑制自噬導致糖酵解基因表達降低，干細胞基因及耐藥基因的表達均降低，細胞凋亡數增加。這項研究表明，自噬與糖酵解可能在細胞耐藥性中發揮核心作用。

目前膀胱灌注的常用化療藥物有表柔比星、吡柔比星、絲裂霉素、阿霉素、羥基喜樹堿等。對于高危NMIBC，免疫增強劑BCG可通過誘導局部免疫反應預防膀胱腫瘤的復發和進展。臨床上，吉西他濱聯合順鉑治療晚期膀胱癌已經成為膀胱癌治療的新標準。牛文杰等[12]的臨床研究證實這種新輔助化療能夠使浸潤性腫瘤直徑減小、分期降低。其安全性和耐受性較傳統的M-VAC方案更勝一籌。

在腫瘤的發生發展中，增強的自噬水平既可為腫瘤細胞提供生存營養和轉移條件，也可誘導腫瘤細胞的凋亡。近年的研究將BCG通過誘導機體局部免疫反應預防膀胱癌復發和進展的非特異性作用稱為訓練免疫，而細胞自噬是這種訓練免疫信號誘導通路的主要參與者之一[13]。Huang等[14，15]通過實驗得出結論，吉西他濱(GEM)在誘導人膀胱癌 T24細胞凋亡的同時還提高細胞自噬，抑制其自噬后 T24細胞對 GEM的化療敏感性即凋亡增加，順鉑誘導的膀胱癌細胞 T24自噬能夠促進其誘導的細胞凋亡過程，證明順鉑誘導的自噬對膀胱癌的治療起積極作用，這也進一步解釋了新輔助化療吉西他濱+順鉑方案有效性的可能原因。最新研究[16]表明，傳統抗瘧藥氯喹能抑制膀胱癌 EJ和 T24細胞被輻射誘導的自噬，從而增加細胞的凋亡。

姜黃素(Cur)是從姜黃的根莖中提取的一種天然化合物，具有抗多種腫瘤的作用[17, 18]。Cur 還能夠增加吉西他濱等傳統化療藥物的療效。Cur能夠誘導 T24 細胞發生自噬，試驗[19]發現用3-MA 聯合 Cur預處理的T24細胞凋亡率顯著低于Cur單獨處理者，說明Cur誘導的細胞自噬與其凋亡誘導效應有關。Kang等[20]通過人膀胱癌細胞T24和J82的體外實驗發現：阿伐他汀可通過促進癌細胞凋亡和誘導細胞自噬水平增加，進一步降低T24、J82的細胞活性。自噬抑制劑可協同促進阿伐他汀的促膀胱癌細胞凋亡作用。

檜木醇是一種從柏科植物中提取的天然化合物，Gao等[21]通過實驗發現，自噬抑制劑3- MA可部分逆轉檜木醇對腫瘤細胞的作用，并通過比較檜木醇和3- MA聯合給藥及檜木醇單獨作用時 LC3-Ⅱ的表達量得出結論，檜木醇激活的不適當的細胞自噬引起了膀胱癌J82細胞的凋亡。用葡萄籽提取物(GSE)處理膀胱癌T24和 HTB9細胞后，不僅癌細胞的生長出現抑制現象，而且細胞死亡數量增大[1]。研究者觀查到GSE處理后的癌細胞中出現胞質空泡。進一步分析證明這些胞質空泡為自噬囊泡。他們在處理癌細胞的同時加入了自噬抑制劑后，癌細胞凋亡明顯增加，證明GSE誘導的自噬起到抑制癌細胞凋亡的作用。而上述觀察到的凋亡和自噬現象均由GSE介導的氧化應激所觸發[22]。淫羊藿素是一種從淫羊藿屬植物中分離得到的黃酮醇苷，體外實驗發現盡管淫羊藿素對正常人胚腎293細胞的細胞毒性比較低，但它能明顯抑制人膀胱癌細胞BT5673和T24的增殖和聚集，通過線粒體膜電位的檢測發現細胞活性也被明顯抑制。進一步的研究發現，當淫羊藿素和表柔比星(EPI)聯合使用時，淫羊藿素通過抑制EPI誘導的細胞自噬，增強了EPI對BT5673和T24細胞增殖的抑制效應[23]。

紫檀芪是首先在紫檀種植物中發現的一種化學成分，對于多種癌癥、高血脂、高血壓都有一定的治療效果。研究[24]發現紫檀芪能夠通過引起細胞周期阻滯、誘導自噬和凋亡有效抑制敏感和耐藥人膀胱癌細胞的生長。粉防己堿(Tet)提取自植物粉防己的根塊，已有研究表明 Tet可逆轉腫瘤細胞耐藥，增加腫瘤治療敏感性[25， 26]。Ni 等[27]通過實驗發現用Tet 處理過的膀胱癌 T24 細胞內自噬泡的數量明顯增多，進一步通過LC3 反轉實驗發現Tet 通過阻斷自噬流下游引起自噬泡增多。

綜上所述，細胞自噬已成為潛在的攻克多種疾病的研究熱點之一。Beclin1的異常表達(甲基化、過表達)可抑制膀胱癌細胞的增殖，細胞自噬水平增加可能通過抑制細胞內源性凋亡抑制膀胱癌細胞凋亡。姜黃素、檜木醇、葡萄籽提取物、淫羊藿素、紫檀芪、粉防己堿等化合物均可通過抑制細胞自噬水平，進一步促進膀胱癌細胞的凋亡。