超聲分散技術前處理的痰標本分枝桿菌培養觀察

田鵬，王俊玲，凌曉潔，張真金，尹詩維，鄧云峰

(山東省胸科醫院漢光國際微生物實驗室,濟南250013)

近年，結核病的發病率居高不下。早發現、早處理對結核病患者的預后具有重要意義。肺結核病依然是我國重點防控的主要傳染病，實驗室診斷是我國十三五結核病防治規劃的核心內容。痰標本的分離培養檢測不僅是結核病實驗室診斷的“金標準”，并且還是開展藥物敏感試驗、分枝桿菌菌種鑒定、基因分型，以及各種基礎研究的前提。影響痰分枝桿菌培養污染率和陽性檢出率最關鍵因素是前處理方法的選擇，因此，改良與創新分枝桿菌培養前處理方法是國內外專家和學者們研究的熱點[1～4]，但目前國內外專家均把改良和創新關注點大多放在了前處理液的選擇上，臨床尚未見將超聲分散技術應用在痰分枝桿菌培養的前處理過程中的報道。目前，越來越多的技術和方法被應用到臨床實驗室，超聲分散技術就是其中之一。超聲分散技術的原理為超聲波發生器發出高頻振蕩信號，在介質中產生高頻機械振蕩，使結團物質在液體內均勻分散。我們采用超聲分散技術前處理了400例份痰標本,并觀察其分枝桿菌培養效果。現報告如下。

1 資料與方法

1.1 標本來源 根據2015年版《結核病實驗室檢驗規程》[5]中痰標本收集的要求，連續收集山東省胸科醫院2018年1～8月間收治的387例疑似肺結核患者的痰液標本，共400例份，標本量為3～5 mL。387例患者中男260例、女127例，年齡12～89歲(50±13)歲。400例份干酪樣痰標本平行均分為A、B、C組及對照組。本研究經本院倫理委員會批準同意，納入者均知情同意并簽署知情同意書。。

1.2 儀器和試劑 超聲分散儀使用廣東體必康生物科技有限公司的超聲波發生器(固定頻率小于50 kHz)，4%氫氧化鈉(NaOH)溶液為本實驗室自配，酸性改良羅氏培養基使用珠海貝索生物科技有限公司產品。研究中獲得的所有培養產物使用BD布魯克質譜儀進行菌株鑒定。

1.3 超聲分散處理及分枝桿菌培養 實驗組采用超聲分散技術進標本前處理，將1 mL痰標本與1～2 mL的4%NaOH溶液混合，放入超聲分散儀中超聲處理1 min，室溫靜置5 min后，接種于酸性改良羅氏培養基進行分枝桿菌培養。對照組根據2015年版《結核病實驗室檢驗規程》分枝桿菌培養標本前處理簡單法操作：將1 mL痰標本與1～2 mL的4% NaOH溶液混合，并在渦旋振蕩器上渦旋震蕩30 s左右直至痰標本充分液化，室溫靜置15 min，接種于酸性改良羅氏培養基進行分枝桿菌培養。

1.4 觀察指標及方法 連續觀察各組分離培養的生長情況，觀察并記錄各組菌株生長并判定為抗酸桿菌陽性的時間，測算各組分枝桿菌培養陽性率(陽性菌株例份/總例份)，各組菌株生長并判定為糠酸桿菌陰性的視為標本被污染，計算標本污染率(陰性菌株例份/總例份)。

1.5 統計學方法 采用SPSS19.0統計軟件進行數據處理。計量資料比較采用秩和檢驗計數資料，以n及%表示，比較采用χ2檢驗。二分類變量及無序多分類變量的組內與組間差異比較采用χ2檢驗，非正態分布的計量資料。P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

實驗組及對照組實驗組及對照組出現陽性菌株時間分別為(20±8.11)、(20±7.67)d。實驗組、對照組分枝桿菌培養陽性率分別為30.0%(120/400)、23.5%(94/400)(P<0.05)。實驗組、對照組培養污染率分別為1.0%(4/400)、4.8%(19/400)(P<0.05)。

同一標本在對照組生長并判定為其它細菌污染而被實驗組報告陽性的為13例份，同一標本在對照組生長并判定為抗酸桿菌陽性而被實驗組報告陰性的為1例份，同一標本在對照組不生長判定陰性而被實驗組報告陽性的為13例份。

3討論

痰標本是一種成分復雜的標本類型，通常情況下可有多種菌體共存,分枝桿菌分離培養標本前處理的目的就是盡可能殺滅痰標本中的污染菌來控制污染率，同時還要最大限度的保持分枝桿菌的活力以提高陽性檢出率。首先，標本的正確采集和留取非常重要。對于痰標本，患者口腔正常菌群、口腔衛生狀況是造成污染的主要原因。文獻[6～8]報道，患者留取痰標本前刷牙、用涼開水或洗必泰漱口，痰培養污染率可明顯降低。其次，操作技術、前處理方法等因素都與痰分枝桿菌培養污染率和陽性檢出率密切相關。大量國內外研究[1～4]顯示，影響痰分枝桿菌培養污染率和陽性檢出率最關鍵因素是去前處理的方法的選擇。WHO現行指南要求前處理時NaOH的終濃度為1%～2%，但也有文獻[9，10]報道，終濃度為1%～2% 的NaOH前處理方法在去除葡萄球菌屬、肺炎克雷伯菌、腸球菌、黏質沙雷菌、嗜麥芽窄食假單胞菌等污染菌方面不是有效的方法。傅津平等[11]提出在痰分枝桿菌培養前處理時采用0.1%新潔爾滅代替4%的NaOH，有較好的前處理效果，痰污染率為0.4%，培陽率為 38.8%。本研究引進新技術成果，將超聲分散技術應用于痰分枝桿菌培前處理的過程，通過分枝桿菌培養陽性率、分枝桿菌培養污染率等指標比較四組不同前處理方法的優劣，以探討超聲分散技術在痰分枝桿菌培養中的應用價值。

本研究采用的對照組前處理方法為經典的技術，從1931年 Lowenstein 和 1932 年 Jensen 發明羅氏培養基(L-J)開始，一直沿用至今，也是我國相關操作指南推薦在基層結核病實驗室廣泛使用的分枝桿菌培養的前處理方法(簡單法)[12]。趙立平[2]等在報道中認為，簡單法的檢出陽性率與離心法接近，但操作相對簡單、污染率較低，初生長時間也相對較短，因而可能更符合臨床的需要。實驗組前處理方法是在簡單法前處理方法的基礎上加入超聲分散技術。超聲分散技術的原理[13]為超聲波發生器能夠發出高頻振蕩信號在介質中產生高頻機械振蕩，使液體振蕩，產生數以萬計的微小氣泡(即空化核)。空化核在聲場的作用下振動，當聲壓達到一定值時，氣泡迅速增長，然后突然閉合，在氣泡閉合時產生沖擊波，在其周圍產生上千個大氣壓，破壞結團的物質，使結團物質在液體內均勻分散，簡稱“空化”作用。Nor Saadah等[14]提出，超聲波在液體中對于細菌的殺傷作用有兩方面，第一產生物理“空化”作用，第二產生化學作用即能使水分子解離，增加去污染溶液的殺菌效果。同時，超聲波在液體中殺菌作用強弱，還與細菌本身特點有關，例如細菌的大小、細胞壁的成分厚薄程度及細菌是否有芽孢莢膜等。

本研究對400例痰標本分離培養總體陽性率和總體污染率以及同一標本在不同組間分離培養生長情況的觀察結果顯示：實驗組的前處理方法與對照組相比較，實驗組分枝桿菌培養陽性率增高且污染率降低，這說明與對照組相比，實驗組能夠在充分保護痰中分枝桿菌活性的基礎上，增加對痰中污染菌的抑制，能夠更好的避免因污染菌生長而造成的陽性標本漏檢；且實驗組前處理過程用時短，縮短了痰分枝桿菌培養實驗過程的時間成本。同一標本在不同組間分離培養的生長情況顯示，對照組19例報告污染的痰標本中，有13例在實驗組報告了培養陽性，也再一次證明了實驗組的前處理方法能更好的避免因污染菌生長而造成的陽性標本漏檢。對13例痰標本分析發現，標本性狀較為特殊，均為十分黏稠的干酪樣痰。這提示可能在處理特殊性狀的痰標本特別是十分黏稠的干酪樣痰時，實驗組的方法更優。

綜上所述， 超聲分散技術前處理的痰標本去污染效果明顯，可有效殺滅痰標本中的污染菌，同時保持分支桿菌的活力，分枝桿菌培養陽性檢出率高，且超聲分散計數前處理所需時間短。