腦出血前后燈盞花素腹腔注射大鼠腦損傷程度觀察

藍先旗，麥惠強，寧曄，王鳳麗，梁仔

(1中山市人民醫院，廣東中山528403;2廣東醫科大學附屬廉江醫院)

腦卒中特別是出血性腦卒中已成為我國居民第一死亡原因[1]。腦出血早期手術清除血腫及藥物保守治療是影響治療效果的關鍵[2]。核因子κB(NF-κB)p65、Notch家族受體蛋白1(Notch1)均為臨床常用的炎癥指標。燈盞花素是從燈盞花全株植物中提取分離的黃酮類有效成分,化學名為4,5,6,三羥基甲酮-7-葡萄糖醛酸苷[3,4]，在清除氧自由基、抗氧化,抑制蛋白激酶C等多方面產生作用,在心血管疾病等領域應用廣泛[5]。近年來，研究[6]發現，燈盞花素治療高血壓、腦出血效果較好。但燈盞花素在出血性腦卒中治療中的具體作用機制鮮被深入探討。2018年1～5月，我們觀察了燈盞花素對腦出血模型大鼠早期腦損傷的影響，并探討其可能作用機制。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 動物、藥物、試劑及儀器 健康SD雄性大鼠96只，體質量280～300 g，由南方醫科大學實驗動物中心提供。燈盞花素(meilunbio公司，貨號MB5170)，大鼠冠狀腦模具(萊艾特，貨號：LAT-DSGZNBJ)兔單克隆抗NF-κB p65(美國CST公司, 貨號：7174S)，DAB顯色液(北京中杉金橋公司)，各相應免疫組化染色試劑盒(北京中杉金橋公司)，IV 型膠原酶0.5U(美國Sigma公司)，戊巴比妥鈉(美國Sigma)，電泳儀及電泳槽(美國Amersham公司)，DBJ_2000凝膠成像系統(英國UVIpro公司)。

1.2 大鼠分組、腦損傷模型制備及燈盞花素給予方法 取96只SD大鼠，隨機分為A(假手術組)、B(腦出血組)、C(低劑量燈盞花素干預組)、D組(高劑量燈盞花素干預組)，每組各24只。B、C、D組采用尾狀核定位注射制作腦出血模型，A組僅針刺尾狀核定位注射。腦出血模型制備方法：戊巴比妥鈉麻醉大鼠，頭部固定于立體定位儀，常規消毒頭皮，于中線約3 mm右側處切開長約1 cm縱行切口，在距離前囟前1.5 mm、中線右側3 mm的位置用牙科骨鉆鉆一個直徑約1 mm小孔，暴露出硬腦膜。用經消毒滅菌的無菌微量注射器抽吸無菌膠原酶Ⅳ 0.2 U(0.2 U膠原酶溶解于1 μL無菌生理鹽水中)，在立體定位儀上將微量注射泵進行安裝固定。通過骨孔中央立體定向地垂直進針進入SD大鼠的腦右側尾狀核(立體定位坐標是：以前囟為參照，前囟前0.1 mm，前囟側3.5 mm，前囟腹側6 mm)，將無菌膠原酶Ⅳ 0.2 U(1 μL)勻速注射，注射時間超過5 min。注射完畢將微量注射器針頭保持在原來位置10 min，阻止回流。A組微量注射器針頭僅同部位針刺，保留相同留針時間，但不進行藥物注射。造模后各組SD大鼠單獨放于鼠籠中，隨意獲得食物和水。C、D組分別于造模前1 h及造模1、6、12 h時腹腔注射50、100 mg/kg的燈盞花素，B組分別于造模前1 h及造模1、6、12 h時腹腔注射1 mL生理鹽水，A組不做任何處理。

1.3 各組大鼠腦出血體積及腦組織含水量測算 造模24 h時每組各取6只大鼠處死，取腦組織切片，得到血腫最大層面，后以切面為起始，2 mm層厚切片，選取所有含血腫切片，依序擺齊，記錄所有標本含血腫層數，并用高分辨攝像機拍攝記錄血腫最大層面。用Image J(V1.45)軟件分析測算最大截面面積，采用“改良多田公式法”估算每個標本的出血體積(V)。V=a×b×c×1/2×0.2，其中a為最大血腫面積層面血腫最長徑，b為最大血腫面積層面上與最長徑垂直最長徑，c為大體組織中出現血腫切片數(默認層厚0.2 cm)。重復3次，取平均值。采用干濕比重法測算各組大鼠腦組織含水量：造模24 h時每組各取6只大鼠，處死后新鮮腦組織，吸除腦組織表面液體，分析天平上稱取其濕重，100 ℃烘干至恒重。計算各組腦含水量比重。腦含水量比重=(濕重-干重)/濕重×100%。重復3次，取平均值。

1.4 各組大鼠血腫周圍腦組織NF-κB p65及腦組織NF-κB p65、Notch1蛋白檢測 ①采用免疫組化法檢測各組大鼠血腫周圍腦組織NF-κB p65。造模24 h時每組各取6只大鼠處死，處死后取新鮮腦組織，制作血腫周圍腦組織石蠟切片。利用Leica Qwin生物醫學圖像分析系統測算各組大鼠血腫周圍腦組織NF-κB p65，NF-κB p65以光密度OD值表示。陰性對照用PBS代替一抗進行孵育，排除假陽性結果。每只大鼠選取2張切片，取6只大鼠平均灰度值為NF-κB p65的相對表達量。②采用免疫蛋白電泳法檢測 各組大鼠腦組織NF-κB p65、Notch1蛋白 。造模24 h時每組各取6只大鼠處死，處死后取新鮮腦組織，采用增強的化學發光來可視化檢測試劑盒使圖像發光，使用Quantity One軟件對蛋白進行定量分析，所有操作均嚴格按照試劑盒說明書進行。重復3次，取平均值。

2 結果

2.1 各組大鼠腦出血體積比較 A、B、C、D組大鼠腦出血體積分別為(1.62±0. 87)、(106.87±25.35)、(79.31±11.46)、(72.69±10.61)cm3，與A組比較，B、C、D組大鼠腦出血體積增加(P均≤0.05)，與B組比較，C、D組大鼠腦出血體積減小(P均≤0.05)，與C組比較，D組大鼠腦出血體積減小(P≤0.05)。

2.2 各組大鼠腦組織干濕比重比較 A、B、C、D組各組大鼠腦組織干濕比重分別為76.71±0.44、82.87±0.86、78.92±1.02、76.66±0.94，與A組比較，B、C組大鼠腦組織干濕比重增加(P均≤0.05)，與B組比較，C、D組大鼠腦組織干濕比重降低(P均≤0.05)，與C組比較，D組大鼠腦組織干濕比重降低(P≤0.05)。

2.3 各組大鼠血腫周圍腦組織 NF-κB p65相對表達量比較 A、B、C、D組大鼠血腫周圍腦組織 NF-κB p65相對表達量分別為46.79±21.52、132.58±13.95、73.63±10.29、51.96±4.83，與A組比較，B、C、D組血腫周圍腦組織NF-κB p65相對表達量增加(P均≤0.05)，與B組比較，C、D組血腫周圍腦組織 NF-κB p65相對表達量降低(P均≤0.05)，與C組比較，D組血腫周圍腦組織 NF-κB p65相對表達量降低(P≤0.05)。

2.4 各組大鼠腦組織NF-κB p65、Notch1蛋白相對表達量比較 A、B、C、D組腦組織NF-κB p65的相對表達量分別為0.24±0.06、0.84±0.09、0.66±0.09、0.56±0.07，A、B、C、D組腦組織Notch1的相對表達量分別為0.44±0.08、0.98±0.10、0.80±0.17、0.74±0.10，與A組比較，B、C、D組腦組織腦組織NF-κB p65、Notch1的相對表達量增加(P均≤0.05)，與B組比較，C、D組腦組織NF-κB p65、Notch1的相對表達量降低(P均≤0.05)，與C組比較，D組腦組織NF-κB p65、Notch1的相對表達量降低(P≤0.05)。

3 討論

腦出血后早期腦損傷病情轉歸除與血腫大小、部位等有關外，主要取決于水腫的程度、炎癥通路的激活狀態。腦出血后早期腦損傷的產生機制既有水腫形成參與，也有各種炎癥凋亡通路如NF-κB信號通路的介導，其中NF-κB p65的是該通路研究的重點之一[7]。新近有研究[8]發現，Notch1是NF-κB凋亡作用的重要上游，其主要分布在血管周圍，且參與血管生長發育調節，其表達與血管新生、血管畸形等有重要關聯。還有研究表明，在腦出血組織中，Notch1表達明顯增加[9]，這進一步研究Notch1與腦出血存在重要關聯。NF-κB p65作為經典NF-κB信號通路的重要成員，其表達在腦出血中明顯增加。

Notch活化酶的抑制劑DAPT γ-分泌酶治療可減少對腦的損傷。 然而，支持這種治療效果的分子機制尚不完全清楚。有研究[10]表明，證明Notch / RBP-J信號傳導在NG2+神經膠質祖細胞和反應性星形膠質細胞如GFAP+細胞，巢蛋白+細胞和RC2+細胞中被激活，使用Notch / RBP-J信號傳導報道小鼠。3天DAPT治療減少了反應性星形膠質細胞的數量，但沒有減少NG2+神經膠質祖細胞的數量。 BrdU標記實驗表明，這種減少是由于反應性星形膠質細胞的增殖減少。 DAPT抑制Olig2的核轉位，Olig2對于反應性星形膠質細胞的增殖和分化是必不可少的。

燈盞花素是從中國藥典收藏重要燈盞細辛中提取的黃銅活性成分，主要藥理作用是降低血液黏度、抑制清除自由基、抗氧化，抑制蛋白激酶C，減輕炎癥反應和改善腦微循環，從而具有減輕腦出血后早期腦損傷的潛力。有研究[11,12]發現，燈盞花素對腦組織炎癥應激起保護作用，且在腦缺血損傷動物實驗中，燈盞花素明顯改善預后。研究[13]證實，燈盞花素可能通過抑制鈣超載、減少自由基釋放其腦保護作用。且燈盞花素對腦損傷是出現的Na+、K+-ATPase和Ca2+-ATPase活性下降有明顯的抑制作用，并能降低腦組織含水量[18]，減輕腦水腫的程度。

腦出血后因受損傷和炎癥刺激，炎癥級聯反應被觸發，炎性因子例如IL-6、TNF-α、MMP-9等釋放增多，通過多種分泌方式與靶細胞上IL-6、TNF-α等受體結合產生作用，其中重要的NF-κB信號通路，可能在腦出血作用下被激活，且通過Notch1這一上游蛋白調控產生作用。本研究結果發現，與B組比較，C、D組大鼠腦出血體積、腦組織干濕比重減小，且D組減少更明顯。與B組比較，C、D組血腫周圍腦組織 NF-κB p65相對表達量降低，且D組降低更明顯。與與B組比較，C、D組腦組織NF-κB p65、Notch1相對表達量降低，且D組降低更明顯，說明燈盞花素在腦出血疾病中的腦保護作用，燈盞花素干預后大鼠腦出血周圍組織中NF-κB p65這一經典炎癥凋亡因子表達明顯減少。燈盞花素可能通過抑制NF-κB p65與Notch1表達產生作用。進一步推斷，燈盞花素可能通過抑制Notch/NF-κB信號通路介導減輕大鼠腦出血模型早期腦損傷。

綜上所述，燈盞花素腹腔注射可減輕腦出血模型大鼠早期腦損傷程度，且高劑量(100 mg/kg)時作用更明顯。其機制可能為抑制NF-κB p65、Notch1的表達。但燈盞花素對腦出血大鼠抗炎癥反應的具體互作機制、治療時合適時間窗、持續時間治療效果等問題尚有待于進一步研究。