糞便多靶點DNA和miR-135b表達聯合檢測診斷結直腸癌的價值

張江國，汪之沫

(1 深圳市蛇口人民醫院，廣東深圳518052；2 深圳市南山區人民醫院)

結直腸癌是消化系統常見的惡性腫瘤，其發病率僅次于胃癌、食管癌。近年來隨著我國居民生活方式改變、人口老齡化加劇等，其發病率呈逐年上升趨勢[1，2]。由于其早期癥狀不明顯，多數患者就診時已屬中晚期，預后往往較差。目前，臨床早期篩查結直腸癌的常用手段有糞便隱血試驗、糞便免疫化學試驗、結腸鏡檢查等，但糞便隱血試驗和免疫化學試驗的敏感性較低，而結腸鏡檢查雖然是篩查結直腸癌的金標準，但檢查費用較高，難以推廣普及。因此，探索一種敏感性和特異性均較高的早期篩查方法具有重要的臨床意義。糞便DNA檢測是一種無創篩查惡性腫瘤的新方法，通常檢測異常骨形態發生蛋白3(BMP3)、N-myc下游調節基因4(NDRG4)基因甲基化以及Kras突變。國內外已有應用糞便DNA檢測篩查惡性腫瘤的報道，如通過糞便DNA中異常BMP3基因甲基化篩查肺鱗癌、異常NDRG4基因甲基化篩查胃癌、Kras突變篩查胰腺癌或胃癌等[3]。微小RNA(miRNA)是在真核生物中發現的一類具有調控功能的內源性非編碼RNA，可參與機體發育、細胞增殖或凋亡等。近年研究發現，在惡性腫瘤組織中有多種miRNA異常表達，并參與惡性腫瘤的發生、發展。miR-135b是miRNA家族中的一員，其在前列腺癌組織中異常表達，并可用于前列腺癌的早期篩查[4]。已有研究證實，糞便多靶點DNA、miR-135b表達單獨檢測對結直腸癌早期篩查的敏感性、特異性和準確性有限[1]，而聯合檢測有可能是最有前景的非侵入性篩查手段。但目前相關報道較少。本研究探討糞便多靶點DNA和miR-135b表達聯合檢測診斷結直腸癌的價值。現報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2016年4月～2017年11月深圳市蛇口人民醫院收治的初診結直腸癌患者35例(觀察組)。所有患者診斷符合《中國結直腸癌診療規范(2015版)》[2]，入院前未行任何抗腫瘤治療，入院后接受手術治療，術后組織病理檢查證實為結直腸腺癌。排除合并心、肝、腎等重要臟器嚴重疾病者，病理學類型為非腺癌者，入組前接受過任何抗腫瘤治療者。其中，男19例、女16例，年齡47～84歲、平均64歲。同期選擇因胃炎、消化性潰瘍等住院的非腫瘤患者39例(對照組)，男24例、女15例，年齡24～84歲、平均48歲。兩組性別構成比較P>0.05，年齡比較P<0.05。本研究經深圳市蛇口人民醫院醫學倫理委員會批準，患者或其家屬知情同意。

1.2 糞便多靶點DNA和miR-135b表達檢測

1.2.1 糞便多靶點DNA檢測 取兩組新鮮糞便標本，采用QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit提取糞便DNA，經NanoDrop-1000超微量分光光度計鑒定，OD260/OD280為1.8～2.0，可用于后續實驗。以提取的糞便DNA為模板，按人類Kras基因7種突變檢測試劑盒說明進行實時熒光定量PCR擴增。BMP3、NDRG4基因甲基化引物序列及其探針序列由武漢安思威科技有限公司設計合成。引物序列：BMP3基因甲基化上游引物5′-GTTTAATTTTCGGTTTCGTCGTC-3′，下游引物5′-CGCTACGAAACACTCCGAAA-3′，檢測探針5′-GACGCGGAGCGGTTTTTTGCG-3′，TaqMan熒光探針FAM-TCTT-BHQ1-AGCCGGTTTTCCGGCTAAGACTCCGCGTCCGT-C6-NH2；NDRG4基因甲基化上游引物5′-CGGTTTTCGTTCGTTTTTTCG-3′，下游引物5′-GTAACTTCCGCCTTCTACGC-3′，檢測探針5′-GAC-GCGGAGGTTCGTTTATCG-3′，TaqMan熒光探針FAM-TCTT-BHQ1-AGCCGGTTTTCCGGCTAAGACTCCGCGT-CCGT-C6-NH2；β-actin上游引物5′-TTTGTTTTTTTGATTAGGTGTTTAAGA-3′，下游引物5′-CACCAACCTCATAACCTTATC-3′，檢測探針5′-CGCCGAGGATAGTGTTGTGG-3′，TaqMan熒光探針VIC-TCTT-BHQ1-AGCCGGTTTTCCGGCTAAGACCTCGGCGCG-C6-NH2。PCR反應體系共20 μL：1×Loading Buffer 15 μL，500 nmol/L上下游引物各0.5 μL，500 nmol/L檢測探針1 μL，250 nmol/L熒光探針1 μL，250 μmol/L dNTP 2 μL，Taq酶1 U，FEN1酶150 U，模板DNA 1×103copies。反應條件：95 ℃ 3 min，95 ℃ 20 s、67 ℃ 30 s、70 ℃ 30 s預擴增10個循環，95 ℃ 20 s、53 ℃ 30 s、70 ℃ 30 s擴增40個循環。以β-actin為內參，利用熒光標記的甲基化基因與內參基因得到兩條實時熒光擴增曲線，設定熒光閾值，得到ΔCT值(CTBMP3-CTβ-actin或CTNDRG4-CTβ-actin)，甲基化指數=2-ΔCT×100%。以BMP3、NDRG4基因甲基化指數均>25%為糞便多靶點DNA陽性[5]。

1.2.2 糞便miR-135b表達檢測 取兩組新鮮糞便標本，采用TRIzol法提取總RNA，經NanoDrop-1000超微量分光光度計鑒定，OD260/OD280為1.8～2.0，可用于后續實驗。按TaqMan miRNA反轉錄試劑盒說明將總RNA逆轉錄為cDNA。以cDNA為模板，按SYBR Green Realtime PCR Master Mix說明進行PCR擴增。引物序列由上海英俊生物技術有限公司設計合成。miR-135b上游引物5′-CCTGGCTTTTCATTCCTATGTGA-3′，下游引物5′-TGGTGTCGTGGAGTCG-3′；U6上游引物5′-GCTTCGGCAGCCACATATACTAAA-3′，下游引物5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。PCR反應體系共20 μL：2×SYBR Premix Ex TaqTM10 μL，上下游引物各2 μL，模板cDNA 2 μL，ddH2O 4 μL；反應條件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s共40個循環。將人工合成的miR-135b配制成濃度分別為0.01、0.1、0、10、100、1 000、10 000、100 000 ng/L的標準反應樣本，經逆轉錄反應和PCR擴增，得到不同濃度樣本的CT值，以濃度對數值為X軸、CT值為Y軸作散點圖，線性擬合后制作標準曲線，得到線性方程Y=2.719logX+10.518 4(R2=0.961 8)。將糞便miR-135b的CT值帶入標準曲線，求出樣本濃度，并量化至1 ng糞便RNA的miRNA copies[4]。

2 結果

2.1 兩組糞便多靶點DNA、miR-135b表達比較 觀察組與對照組糞便多靶點DNA陽性例數分別為23(65.71%)、4例(10.26%)，糞便miR-135b表達分別為(72.8±18.2)、(34.5±20.0)copies/ng，兩組比較P均<0.01。

2.2 糞便多靶點DNA、miR-135b表達單獨和聯合檢測診斷結直腸癌的價值分析 ROC曲線分析顯示，糞便多靶點DNA陽性單獨檢測診斷結直腸癌的曲線下面積為0.78(95%CI：0.68～0.88)，此時其診斷結直腸癌的敏感性為70%、特異性為90%；糞便miR-135b表達單獨檢測診斷結直腸癌的曲線下面積為0.86(95%CI：0.80～0.93)，其cut off值為69.9 copies/ng，此時其診斷結直腸癌的敏感性為91%、特異性為81%；糞便多靶點DNA陽性與miR-135b表達聯合檢測診斷結直腸癌的曲線下面積為0.93(95%CI：0.89～0.98)，其診斷結直腸癌的敏感性為97%、特異性為74%。糞便多靶點DNA陽性與miR-135b表達聯合檢測診斷結直腸癌的ROC曲線下面積明顯高于糞便多靶點DNA陽性單獨檢測(P<0.05)，與糞便miR-135b表達單獨檢測的ROC曲線下面積比較P>0.05。

3 討論

近年來，隨著居民生活方式改變、人口老齡化加劇等，我國結直腸癌的發病率呈逐年上升趨勢[1，2]。由于其早期癥狀不明顯，多數患者就診時已屬中晚期，預后往往較差。早發現、早診斷、早治療是提高結直腸癌患者預后的關鍵。目前，臨床早期篩查結直腸癌的常用手段有糞便隱血試驗、糞便免疫化學試驗、結腸鏡檢查等。其中，糞便隱血試驗早期篩查結直腸癌的敏感性和特異性均較低；糞便免疫化學試驗雖然篩查結直腸癌的敏感性較高，但其特異性較差；結腸鏡檢查是診斷結直腸癌的金標準，但其檢查費用較高，難以大規模推廣。因此，探尋一種價格低廉且敏感性和特異性均較高的結直腸癌篩查方法具有重要意義[4]。

糞便DNA檢測是一種無創篩查惡性腫瘤的新方法，通常檢測異常BMP3、NDRG4基因甲基化以及Kras突變。國內外已有應用糞便DNA檢測篩查惡性腫瘤的報道，如通過糞便DNA中異常BMP3基因甲基化篩查肺鱗癌、異常NDRG4基因甲基化篩查胃癌、Kras突變篩查胰腺癌或胃癌等。BMP3、NDRG4基因過度甲基化會導致基因轉錄沉默，從而抑制BMP3、NDRG4蛋白合成，進而促進結直腸癌的發生、發展。Kras是ras基因家族成員，具有調控細胞生長作用，如Kras突變時，該基因會永久活化，其編碼的ras蛋白異常，可使結直腸細胞增殖失控繼而癌變[6，7]。有研究報道，應用糞便BMP3、NDRG4基因甲基化和Kras突變等基因檢測篩查結直腸癌的敏感性要明顯高于糞便免疫化學試驗[8，9]。miRNA是在真核生物中發現的一類具有調控功能的內源性非編碼RNA。近年研究發現，在惡性腫瘤組織中存在多種miRNA異常表達，并參與惡性腫瘤的發生、發展。miR-135b是miRNA家族中的一員，其在胃癌、骨肉瘤等實體腫瘤中表達明顯升高。miR-135b能夠靶向抑制抑癌基因APC表達，故其表達上調可促進腫瘤的發生、發展[10,11]。Wu等[4]研究發現，糞便miR-135b表達篩查結直腸癌的敏感性為78%、特異性為68%，提示糞便miR-135b表達檢測可作為篩查結直腸癌的非侵入性手段之一。糞便BMP3、NDRG4基因甲基化異常和Kras突變能夠在轉錄水平上反映腫瘤細胞存在，而糞便miR-135b表達異常能夠在轉錄后基因調控水平上反映腫瘤細胞存在。但已有研究證實，糞便多靶點DNA陽性、miR-135b表達單獨檢測對結直腸癌早期篩查的敏感性、特異性和準確性有限，而聯合檢測有可能是最有前景的非侵入性篩查手段。本研究結果發現，觀察組糞便多靶點DNA陽性例數明顯高于對照組，糞便miR-135b表達亦明顯高于對照組，表明結直腸癌患者存在糞便多靶點DNA甲基化和miR-135b表達異常，有可能成為結直腸癌篩查的指標。

由于表觀遺傳修飾是對環境壓力的一種動態反應，BMP3、NDRG4基因超甲基化和Kras突變可能存在腫瘤細胞內或細胞間的表觀遺傳異質性[12～14]，故單分子表觀遺傳學檢測診斷結直腸癌的敏感性和特異性較低。結直腸癌組織miR-135b表達可能亦存在異質性，因此單獨檢測糞便miR-135b表達診斷結直腸癌的效能可能較低[15，16]。本研究結果發現，糞便多靶點DNA陽性單獨檢測診斷結直腸癌的ROC曲線下面積為0.78，其診斷敏感性為70%、特異性為90%，與Cooper等[14]研究結果相似；糞便miR-135b表達單獨檢測診斷結直腸癌的ROC曲線下面積為0.86，其cut off值為69.9 copies/ng，此時其診斷敏感性為91%、特異性為81%，略高于Wu等[4]的研究結果，可能是由于Wu等[4]的研究隊列中包括IBD患者，從而影響了糞便miR-135b表達診斷結直腸癌的敏感性和特異性。進一步研究發現，糞便多靶點DNA陽性與miR-135b表達聯合檢測診斷結直腸癌的ROC曲線下面積明顯高于糞便多靶點DNA陽性單獨檢測，提示糞便多靶點DNA陽性與miR-135b表達聯合檢測較糞便多靶點DNA陽性單獨檢測具有更好的診斷效能；糞便多靶點DNA陽性與miR-135b表達聯合檢測診斷結直腸癌的ROC曲線下面積雖高于糞便miR-135b表達單獨檢測，但差異無統計學意義，可能是糞便多靶點DNA陽性與miR-135b表達聯合檢測的診斷效能與糞便miR-135b表達單獨檢測的診斷效能確實沒有統計學差異，也可能是由于病例的局限性，聯合檢測的診斷效能未能得到充分發揮，尚需進一步臨床研究驗證。

綜上所述，糞便多靶點DNA和miR-135b表達聯合檢測對結直腸癌的診斷效能較高，有可能作為結直腸癌早期篩查的方法在臨床中推廣應用。