不同標本類型對肺結核病原體檢測的臨床價值

杜秋蓉，杜 笠，胡瓊英，劉祥琴

(1.成都中醫藥大學附屬醫院檢驗科，四川 成都 610075；2.成都天府新區人民醫院檢驗科，四川 成都 610213；3.四川省醫學科學院·四川省人民醫院檢驗科，四川 成都 610072)

結核分枝桿菌是引起結核的病原菌。據世界衛生組織統計，2017年有130萬人死于結核病[1]，且每年多達1000萬人繼續患結核病，仍然是全球主要的健康威脅[2]。結核分枝桿菌主要檢測的途徑有抗酸染色涂片法，細菌快速培養法以及利用熒光PCR法。根據大量文獻的研究結果顯示，熒光PCR的檢測方法對結核分枝桿菌的檢出率較高，也是快速、特異、準確且經濟的方法，優于抗酸染色涂片法和細菌快速培養法等各類方法[3～5]。本文收集了四川省人民醫院及成都中醫藥大學附屬醫院2017年1月至2018年7月確診為肺結核的132例患者的標本，進行結核分枝桿菌核酸檢測，分析檢測結果，從而探索標本類型(支氣管灌洗液、痰液、血液)對肺結核檢出情況。

1 資料與方法

1.1 一般資料2017年1月至2018年7月四川省人民醫院及成都中醫藥大學附屬醫院門診就診的132例肺結核患者，均根據《中華人民共和國衛生行業標準肺結核診斷標準(WS288-2017》[6]確診，同時采集痰液、支氣管灌洗液及血標本送檢，進行熒光PCR技術，分析檢測結果。

1.2 儀器與試劑儀器：美國ABI 7500實時熒光PCR儀。試劑：達安基因股份有限公司結核桿菌核酸檢測試劑盒(PCR-熒光法)。

1.3 方法

1.3.1標本的采集 ①痰液的采集及處理：用無菌杯取受檢者肺深部咳出痰液1～3 ml密閉送檢。痰液中加入1倍體積的4%NaOH，37 ℃放置30分鐘左右液化(每間隔10分鐘搖勻一次)，取1.0 ml到1.5 ml離心管中，振蕩搖勻，離心12000 rpm 5分鐘。去上清，沉淀加無菌生理鹽水1 ml混勻，再次12000rpm離心5分鐘，重復洗滌兩次，移去上清，沉淀備用。②支氣管灌洗液的采集及處理：用無菌杯收集支氣管灌洗液5～10 ml密閉送檢，所取標本有黏液時同痰標本的處理；無黏液時，混勻后取1 ml離心12000 rpm 5分鐘，移去上清，沉淀加無菌生理鹽水1 ml混勻，再次12000rpm離心5分鐘，洗滌一次，移去上清，沉淀備用。③血液的采集及處理：抽取靜脈血1 ml(抗凝)，用生理鹽水稀釋1 ml，慢慢轉移至含淋巴細胞分離液1 ml的無菌管中(切勿混勻)，離心2000 rpm 10分鐘，吸取白細胞層于1.5 ml離心管，離心12000 rpm 5分鐘，棄上清，沉淀加無菌生理鹽水1 ml混勻，離心12000 rpm 5分鐘，洗滌一次，移去上清，沉淀備用。

1.3.2核酸的制備 將上述備用的沉淀標本中分別加入50 μl TB-DNA提取液充分混勻，6000 rpm離心60秒，置于100 ℃金屬浴10分鐘裂解，待冷卻后取出，12000rpm離心5分鐘，上清液備用。

1.3.3質量控制 試劑盒的陰性對照及質控物與檢測標本同樣處理，提取核酸。

1.3.4PCR擴增 取單管單人份的TB-DNA的PCR反應管若干(N+2個，N代表樣本數，2分別代表一個陽性質控，一個陰性質控)，分別加入處理后樣品或者陰性質控品、陽性質控品5 μl，并6000rpm離心60秒。將上述各反應管放入ABI 7500型實時熒光PCR儀內進行擴增，反應條件：93 ℃→2分鐘預變性，之后93 ℃ 45秒→55 ℃60秒，反應10個循環，93 ℃ 30秒→55 ℃45秒30個循環。

1.3.5結果分析 反應結束后，將檢測結果的數據保存至電腦，然后對圖像結果進行分析并調節baseline的start值(2～4)，stop值(7～9)及Threshold值，再到Reporter窗口觀察并記錄儀器自動分析得出的Ct值。質控：陰性質控為陰性(Ct值>臨界陽性質控，同時Ct值≥30)，擴增曲線無增長，則本次實驗有效；陽性質控為陽性(Ct值<臨界陽性質控Ct值)，有明顯擴增曲線，則本次實驗有效。標本結果判斷，在陰、陽性質控結果有效的情況下，陰性結果Ct值≥30，無擴增曲線，則結果判斷為陰性。如Ct值<28，有明顯擴增曲線，則結果判斷為陽性。

1.4 統計學方法采用SPSS 22.0軟件分析數據。計數資料比較采用卡方檢驗。P< 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

132例患者三種不同標本中，支氣管灌洗液檢出結核分枝桿菌123例，未檢出9例，陽性檢出率93.2%；痰液檢出結核分枝桿菌94例，未檢出38例，陽性檢出率71.2%；血液檢出結核分枝桿菌5例，未檢出127例，陽性檢出率3.8%。檢出率最高的標本為支氣管灌洗液，其次為痰液，最低為血液標本。見表1。

表1 三種標本檢出TB-DNA的陽性結果比較

①與痰液比較，χ2=21.8，P< 0.05；②與血液比較，χ2=211.2，P< 0.05；③與血液比較，χ2=128.0，P< 0.05

3 討論

結核病的病原體是由分枝桿菌屬的結核分枝桿菌復合菌群感染所致，該復合菌群含有引起人和動物感染發病的若干亞群，這些亞群感染人體組織后其臨床表現類似，引起的組織學改變也相似，都能導致肉芽腫性炎變，伴或不伴干酪樣壞死[7]。由于該類細菌抗酸染色都呈陽性，因此單純依據抗酸染色結果和組織學改變來診斷結核病并不可靠。然而利用熒光PCR的方法進行TB-DNA的PCR反應，每復制1個特異核苷酸片段，就有1個探針被切斷，并釋放一個熒光信號。因為被釋放的熒光基團數目和PCR產物是一對一的關系，所以用熒光檢測技術檢測出的熒光信號有無或強弱，則代表擴增產物有無或多少。熒光PCR技術對結核分枝桿菌的診斷具有快速、特異、敏感等特點，因此也成為結核病分子診斷的最有力的方法[8]。本文利用熒光PCR技術對臨床常用三種標本(痰液、支氣管灌洗液、血液)進行結核分枝桿菌檢測，并對檢測結果進行了分析，其目的就是為臨床提供科學的、合理的采集標本。

對于血液標本來說，由于結核分枝桿菌的生長特點，一般不會是在血液中繁殖，只是通過血液等傳播到相應的組織、器官等形成病灶，血液具有流動性，在血液中采集結核分枝桿菌具隨機性，故而血液中的結核分枝桿菌不易采集到且其存在的量也很少。再次，只有在結核分枝桿菌感染早期或者通過血液再次繼發感染其他組織或者器官時，血液標本才可能檢測到結核分枝桿菌(臨床認知不足，認為采血方便)，所以血液標本對結核分枝桿菌檢出率很低。本研究結果也證實了這一點。在確診肺結核患者的132例血液標本，檢出陽性的只有5例，未檢出的則占大部分。

對于痰液標本，現在的患者并不都能完全的深咳出合格痰液，且肺結核患者多為少痰或無痰，再次，臨床結核的排菌特點——間歇排菌，導致臨床上痰找抗酸桿菌陽性率低，易漏診誤診[9]。所以從本試驗確診肺結核的痰液標本共132例，檢出的有94例，檢出率僅有71.2%，未檢出的有38例。而支氣管灌洗液檢出率達93.2%，這與痰液標本檢出率71.2%相比較，就可說明這132例患者痰液中未檢測出陽性結果的不是患者本身沒有結核分枝桿菌，而是采集到的標本可能沒有結核分枝桿菌存在，檢出率自然降低。故臨床醫生選擇痰液標本，為避免漏檢，應多次采樣檢測。

肺泡灌洗液是利用支氣管鏡向支氣管及肺泡內注入生理鹽水并吸出。收集肺泡表面的有效液體進行可溶物或者細胞的檢查。對于支氣管灌洗液，采集此類標本時，肺泡灌洗液進入遠端氣道和肺泡腔中，接觸病灶范圍較廣，標本量較大，含菌量較多且借助外力采取，因此主觀影響因素較少，最后標本充分離心沉淀，檢出率可大大提高。同時，灌洗刺激患者咳嗽，更有利于局部支氣管分泌物的引流，還可避免口咽部細菌對樣本的污染[10]。并且，支氣管肺泡灌洗術是一種安全的檢測方法，即使對兒童，其安全性也能得到保證[11]。以上充分證實了，支氣管灌洗液此類標本是檢測肺結核中結核分枝桿菌的最佳標本類型。然而，在此次的調查結果中利用支氣管灌洗液這類標本檢測結核分枝桿菌，有9例患者未測得陽性結果，其原因有可能是標本采集不當，或未采集到結核分枝桿菌，也有可能是采集到的細菌數量較少，在利用熒光PCR法提取標本時，未提取到達檢測范圍的量，未能檢測出。所以，針對結核分枝桿菌的檢測都應多次采樣檢測，以防漏檢。

總之，利用熒光PCR測定肺結核中的TB-DNA，檢出率最高的標本類型是支氣管灌洗液，支氣管灌洗液的檢出率遠遠高于痰液和血液的檢出率。這與多年利用熒光PCR法測定結核分枝桿菌的實驗結果發現相吻合，證實了血液對于結核分枝桿菌的檢測確實檢出率太低，檢測價值不大這一結論。提示臨床醫生在選擇利用PCR技術檢查肺部及肺周結核分枝桿菌時可首選支氣管灌洗液這類標本，并且不同時段多次采樣，減少漏檢率。因此，利用熒光PCR技術檢測支氣管灌洗液中的TB-DNA，這一方法和實驗標本可以準確，簡便，快速測定出結核分枝桿菌，其值得推廣應用。