術中快速檢測甲狀旁腺激素的膠體金免疫層析試紙的研制

陳 超，唐振林，楊佳良

(四川省醫學科學院·四川省人民醫院 a.血管甲狀腺外科，b.核醫學科，四川 成都 610072)

近年來，我國甲狀腺結節尤其是甲狀腺癌的發病率快速上升，需要行甲狀腺全切除術和(或)頸淋巴清掃術的患者不斷增加。部分患者因甲狀腺手術中誤切、損傷甲狀旁腺或因為其血供改變導致了繼發性甲狀旁腺功能減退，一直是甲狀腺術后的嚴重的并發癥，發生率為0.5%～32%[1，2]。臨床表現輕者出現手腳發麻、抽搐，重者甚至可危及生命，給患者帶來身體和心理上的極大痛苦，同時也給術者帶來巨大的工作和心理壓力。因此，術中如何準確辨認、識別并且有效保護甲狀旁腺來降低術后甲狀旁腺功能減退的發生，一直是世界各國研究甲狀腺疾病的重要課題。膠體金免疫層析(GICA)技術是一種將膠體金標記技術、免疫檢測技術和層析分析技術等多種方法結合在一起的固相標記免疫檢測技術，具有簡便、省時便捷、采樣隨意、用量少、結果易判讀等特點，已廣泛應用于抗原、抗體的檢測，以及各種蛋白質、激素及藥物等的檢測。我院2016年1月至2017年12月利用GICA技術，研制金標免疫層析試劑條，通過術中檢測組織液中的PTH，從而快速判斷甲狀旁腺，操作快捷、簡單、實用。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑材料主要儀器：Techcomp離心機，劃膜儀、噴金儀、切條機，均來自上海金標生物公司。主要試劑：甲狀旁腺激素標準品，BSA-PTH(甲狀旁腺激素偶聯BSA)購自上海強耀生物科技有限公司；羊抗鼠IgG(15.4 mg/ml)、抗PTH單克隆抗體(15.4 mg/ml)均來自ABCOM公司。材料：硝酸纖維素膜(型號：CNl40)來自賽多利斯(sartorius Stedim)公司；玻璃纖維棉購自上海良信生物科技有限公司；吸水紙由上海金標生物科技有限公司提供。

1.2 制備方法

1.2.1膠體金溶液的制備 采用檸檬酸三鈉還原氯金酸法制備膠體金，氯金酸溶液與檸檬酸鈉溶液的體積比為100∶150 μl。

1.2.2膠體金標記 采用棋盤法進行篩選。用 25 mmol/L K2CO3溶液調節膠體金溶液pH值分別為7、8、9、10，分別于不同pH值膠體金溶液中加入PTH抗體溶液，震蕩混勻20 min，靜置30 min，分別加入10 μl的10% NaCl溶液，混勻，靜置30 min，觀察標記后膠體金溶液顏色的變化，記錄其顏色變化差異及變為紅色的保持時間，以顏色變化明顯的膠體金溶液與抗體溶液的比例為膠體金標記的最佳標記比例，以最佳標記比例下紅色保持時間最長的pH值為膠體金標記的最佳標記pH值。

1.2.3膠體金-PTH單克隆抗體結合物的制備 取膠體金，在磁力快速攪拌下加入稀釋的抗PTH單克隆抗體，攪拌后，加入牛血清白蛋白(BSA)，再攪拌后離心棄沉淀，上清液再以離心，吸去上清液，沉淀即為膠體金-PTH單克隆抗體結合物，4 ℃保存，備用。

1.2.4金標結合墊的制備 選擇玻璃纖維膜作為金標結合墊，將玻璃纖維膜浸泡于0.1 mmol/L pH 8.8 Tris-HCl 緩沖液中5 min，取出，37 ℃烘干。將烘干后的結合墊浸泡于PTE膠體金標記物溶液中，至溶液全部吸收，取出，37 ℃干燥，備用。

1.2.5劃膜 硝酸纖維素膜為試紙的檢測區，如圖1設有質控線(C線)，和檢測線(T線)，C線包被15.4 mg/ml羊抗鼠 Ig G和羊抗兔Ig G，T 線分別包被濃度為0.5 mg/ml、1.0 mg/ml、1.66 mg/ml的半抗原 (BSA-PTH)，劃膜儀調節劃膜量為1 μl/cm，劃膜后置干燥間室溫干燥過夜。見表1。

表1 劃膜3張不同濃度T線的試紙條對比

1.2.6試紙條的組裝 將干燥好的硝酸纖維素膜預粘貼于PVC膠板上，確定檢測線和質控線的位置，在硝酸纖維素膜上方(C線側)粘貼吸水紙，吸水紙壓住膜約1 mm；在硝酸維素膜下方粘貼金墊，金標墊壓住膜約1 mm；在金標墊下方粘貼樣品墊，樣品墊壓住金標墊約2 mm。試紙組裝工藝如圖1所示。組裝完成后按3 mm寬度切為成品小條，裝入檢測卡盒中即制成膠體金免疫層析試紙條。

圖1 試紙條組裝示意圖

1.3 檢測方法

1.3.1加樣 將甲狀旁腺激素標準品稀釋不同濃度，檢測試紙條水平放置，取100 μl待測樣品滴于加樣孔，第10～15 min時判定結果，15 min后的結果無效。

1.3.2結果判讀 將待檢PTH標準品液滴在試紙條上，如果樣品中的PTH低于檢測限濃度，則不能競爭抑制金標抗體與包被在硝酸纖維素膜上的BSA-PTH進行第一次免疫反應，金顆粒在硝酸纖維素膜表面沉淀析出形成一條紅色條帶(T線)，然后其他未結合的金標抗體繼續通過毛細作用向前泳動，同樣也形成一條紅色條帶(C線)，這樣形成兩條紅色條帶表示樣品檢測結果為陰性；反之，當樣品中含有的PTH高于檢測限濃度時，溶解后的金標抗體大部分與樣品中的PTH進行第一次免疫反應，僅形成一條紅色條帶(C線)，表明樣品檢測結果為陽性。無論樣品中有無PTH，測試結果C線位置都應出現紅色條帶，如果無紅色條帶出現則表明測試無效。見圖2。

圖2 PTH膠體金試紙結果判定示意圖

2 結果

2.1 膠體金溶液質量鑒定膠體金溶液外觀純凈、透亮，無沉淀及漂浮物。采用紫外分光光度計掃描，膠體金溶液最大吸收峰波長為 520 nm，在可見光范圍內由單一吸收峰，說明膠體金顆粒比較均勻，大小在20 nm左右。

2.2 膠體金標記條件的確定當pH為8.0，PTH抗體標記量為0.4 mg/ml，膠體金溶液與PTH抗體標記比例為3∶1時，金標溶液穩定，保持紅色不變。由此確定膠體金標記抗體的最適pH為8.0。

2.3 樣品檢測結果從表2可看出，檢測線即包被的BSA-PTH濃度在1.66 mg/ml，PTH標準品濃度在1u/ml是，試紙條呈弱陽性，PTH標準品濃度大于10 μg/ml時結果呈陽性，見圖3。PTH的最低檢測濃度為1 μg/ml，最適T線濃度為1.66 mg/ml。而術中組織液中PTH濃度大于500 pg/ml。本實驗結果表明：本試紙可以對甲狀旁腺激素準作出定性判定，符合預期目標。

表2 不同樣品濃度檢測結果

圖3 檢測陽性結果

3 討論

對于甲狀腺惡性腫瘤，最有效的治療方法是外科手術，但術中因損傷、誤切或影響血供而導致的甲狀旁腺功能減退是甲狀腺術后最常見的并發癥[3]。由于甲狀旁腺體積小，其周圍有甲狀腺、脂肪、淋巴結、肌肉等組織，在術中只能憑經驗鑒別，有一定的意外切除率[4]。術中如何顯露和識別甲狀旁腺，一直是手術的重點和難點，目前國內外尚無一種確切有效的方法，手術醫生主要靠主觀經驗識別甲狀旁腺，術中精細化解剖保護甲狀旁腺。如遇甲狀腺癌需行中央組淋巴結清掃，特別是雙側淋巴清掃，對甲狀旁腺的損傷幾乎不可避免，尤其是下位甲狀旁腺，基本處于淋巴結清掃范圍內。目前病理仍是鑒別甲狀旁腺的金標準，但這需要切除部分甲狀旁腺組織，術中等待時間長、費用高。細針穿刺組織洗脫液的PTH檢測，用于術前和術中鑒別甲狀旁腺的方法，已有文獻報道[5，6]。

人體內只有甲狀旁腺分泌PTH，因而甲狀旁腺組織中PTH水平遠高于血清PTH水平，而周圍組織、血液的PTH水平均與血清中PTH水平相當，在血清PTH正常值范圍內。Perrier等報道[7]，甲狀旁腺腺瘤切除術65例患者行術中細針穿刺抽吸組織液測定PTH，44份細針抽吸腺瘤組織測定PTH值均高于血清中PTH的所能測定的上限值；剩余組織經病理證實不是甲狀旁腺組織。2004年Kiblut等報道了在170例患者中進行的前瞻性試驗，術中對甲狀腺、正常甲狀旁腺、增生甲狀旁腺組織采用細針穿刺抽吸組織測定PTH并進行了對比，得出了相同的結論[8]。可見，甲狀腺術中通過測定組織液的PTH來判定甲狀旁腺是可行的。

目前PTH的檢測一般是通過電化學發光的方法進行的，需大型的檢測設備，加上運送標本，檢測時間至少需60 min以上，推廣應用在臨床上有難度。以膠體金為標記物的GICA技術是以硝酸纖維素膜為固相載體，通過毛細作用使樣品溶液在層析條上泳動，并同時使樣品中的待測物與層析材料上針對待測物的受體(抗原或抗體)發生高特異性、高親和性的免疫反應，層析過程中免疫復合物被富集或截留在層析材料的一定區域(檢測帶)，運用可目測的標記物(膠體金)而得到直觀的實驗現象(顯色)。目前應用最廣泛和最成功的是妊娠試驗，早早孕試紙條通過檢測尿液中人絨毛膜促性腺激素(HCG)以輔助診斷早期妊娠的檢驗方法，已在家庭和個人中廣泛應用。通過本研究表明，通過膠體金免疫層析的方法來檢測甲狀旁腺激素是可行性的，為外科醫生提供了一種快速、準確，且在術中就能實現甲狀旁腺定性的鑒別方法，以便于術中更好地保護甲狀旁腺，降低患者術后甲狀旁腺功能減退的發生率。