miR-1與驚恐障礙發病及療效的關聯性研究

閔文蛟，黃雨蘭，汪瑾宇，鄒志禮，楊程惠，周 波

(四川省醫學科學院·四川省人民醫院心身醫學中心，四川 成都 610072)

驚恐障礙以反復心悸、氣緊等發作，伴強烈瀕死感或失控感為特征；患者常反復就醫，社會功能受到嚴重影響。目前認為遺傳因素對PD發病具有重要作用[1]。miRNA可參與調節大約30%的人類蛋白質翻譯，成為腦發育異常、神經遞質改變和不同治療反應的統一鏈接[2]。miRNA-1廣泛存在于甲狀腺、心臟等器官中，與代謝性疾病、精神疾病等密切相關[3]。本研究探討miR-1與驚恐障礙發病及藥物療效的關聯性，為疾病預測及治療轉歸提供可能的血清標志物。

1 資料與方法

1.1 一般資料2014年7月至2015年8月我院收治的67例驚恐障礙住院患者，納入標準：①中國漢族驚恐障礙患者，年齡18～55歲，性別不限；②符合《美國精神障礙診斷與統計手冊》第四版(DSM-IV) 驚恐障礙診斷標準，由統一培訓的富有經驗的精神科醫師通過系統精神檢查確診(其一致性檢驗的Kappa值大于0.8)；③14項基線漢密爾頓焦慮量表(HAMA)量表評分>14分[1]；④入組前2周內未接受任何抗焦慮藥物治療(其中4周內未接受氟西汀治療)；⑤未接受任何激素治療；⑥女性患者未使用任何口服避孕藥物；⑦簽署知情同意書。排除標準：①既往患有或合并其它精神疾病，包括精神分裂癥、雙相情感障礙、抑郁癥、精神活性物質濫用或依賴、強迫癥、精神發育遲滯以及藥物所致精神障礙等，以及存在軸Ⅱ類疾病，包括人格障礙等；②患有嚴重軀體疾病，包括內分泌、心血管疾病、神經系統疾病等，嚴重腦外傷史，體格檢查或實驗室檢查發現明確異常者；③懷孕或哺乳期婦女。同期63例西南地區漢族健康人群(對照組)，年齡18～55歲，性別與病例組匹配，且具有相似的人文地理背景。并由統一培訓的評估人員使用DSM-IV軸I定式臨床精神檢查(SCID-NP)，排除目前或既往患有精神疾病或嚴重軀體疾病者。

1.2 方法

1.2.1評估與治療 收集所有研究對象的年齡、性別、文化程度、婚姻等基本人口學資料。病例組患者在入組時進行基線HAMA-14及驚恐障礙嚴重程度量表(PDSS)評估；入組后接受為期6周的舍曲林治療(50～200 mg/d，根據病情調整劑量)，期間除失眠及發作時使用阿普唑侖或吸氧治療外，不能使用其它藥物及非藥物治療方案。治療結束后，所有患者再次接受HAMA-14及PDSS量表評估。HAMA-14包含2個因子：軀體性焦慮(7～13條目)、精神性焦慮(1～6和14條目)。PDSS減分率超過40%被定為臨床有效；HAMA-14得分小于7分且無驚恐發作及社會功能損害被定為臨床治愈[1]。

1.2.2血樣采集及遺傳學實驗 所有研究對象在入組時均采集5 ml外周靜脈血，病例組在6周治療完成后再次采集5 ml外周靜脈血。所有采集的血樣標本使用EDTA抗凝，4°C離心分層，保留上層清液(血漿)，并留取1 ml進行RNA提取。根據說明使用TRIZOL-LS試劑提取血漿RNA，并使用NanoDrop ND-1000進行RNA濃度和純度檢測。使用ViiA7 RT-PCR系統檢測樣本中miR-1表達水平，引物：F：5’ GGGGTGGAATGTAAAGAAGT3’，R：5’CAGTGCGTGTCGTGGAGT3’。8 μl反應液體系如下：1 μl cDNA、5 μl 2倍Master混合液、10 μM的正反引物各0.5 μl、1 μl純凈水。PCR反應條件如下：95°C預變性10分鐘，之后95°C變性10秒、60°C退火60秒、95°C延伸15秒，此三步重復40個循環。使用hsa-miR-423-5p作為內參[4]，并使用2-ΔΔCt法進行相對表達水平計算。

1.3 統計學方法采用SPSS 18.0統計學軟件處理數據。計量資料比較采用t檢驗，計數資料比較采用卡方檢驗；相關性分析采用Pearson相關分析。檢驗水準α=0.05。

2 結果

納入的研究對象中，7例患者及3例健康對照者血樣標本不合格(血樣標本量過少或溶血)而剔除。最終60例患者及60例對照者納入統計分析。

2.1 兩組基本人口學資料及miR-1表達水平比較

病例組男∶女=2∶3，年齡(35.13±10.09)歲，對照組男∶女=4∶11，年齡(32.13±7.62)歲，兩組基本人口學資料比較，差異無統計學意義(P> 0.05)。病例組miR-1表達水平低于對照組(1.098±0.388vs4.117±2.643，t=-4.375，P<0.001)。

2.2 治療前miR-1表達水平與臨床特征及量表評分的相關性分析miR-1表達水平與發病年齡及病程均無相關(P> 0.05)。miR-1表達水平與HAMA13條目(自主神經癥狀)和PDSS3條目(預期性焦慮的嚴重程度)得分呈負相關(P<0.001)，見表1。

表1 治療前miR-1表達水平與HAMA-14、PDSS量表評分的相關性

2.3 治療前后miR-1表達水平比較治療后miR-1表達水平較治療前下降(1.098±0.388vs0.377±0.369，t=5.14，P< 0.001)。miR-1表達水平的變化與HAMA-14、PDSS量表各項評分變化之間不存在關聯性(P> 0.05)，見表2。

3 討論

雖然遺傳因素被認為在驚恐障礙的發生發展中具有重要作用，連鎖關聯性分析亦發現數個致病相關基因多態性，如COMT的val158 met、TPH的rs4570625、5-HTTLPR等[5]。但其研究結果目前尚不一致，陽性重復率較低[6]。而miRNA被認為可能代表了一種新層次上的基因表達調控方式，其表達量的改變會影響腦內許多相關基因的表達，在精神障礙的基因組復合結構網絡中起到重要調控作用[7]。同時，既往研究發現，抗精神病藥物亦可改變體內特定miRNA的表達，并隨病情改善而變化[8]。Kim等在韓國人群中發現miR-22、miR-491多態性變異與驚恐障礙遺傳易感性相關[9]。但迄今為止，關于驚恐障礙的miRNA相關研究較少，結果可重復性不高，尚處于起步階段。

表2 治療前后miR-1表達水平變化與HAMA-14、PDSS量表評分變化的相關性

△治療前后量表評分變化值；#治療前后miR-1表達水平變化

miRNA-1是一種研究較為廣泛的miRNA分子，在多種疾病發生及治療中具有重要作用。研究發現，miR-1在肝癌、肺癌、前列腺癌、胰腺癌等多種腫瘤疾病中表達下調[10]，其上游啟動子C/EBPα(含亮氨酸鋅指結構域的轉錄因子家族成員) 常在上述疾病中失活。miR-1能調節多種致癌基因的表達，并在下游經典致癌基因信號通路中發揮關鍵作用[11]；它可以調節甲基化相關酶而改變腫瘤細胞DNA的甲基化狀態，從而調節腫瘤的生長和轉移。此外，miR-1通過抑制Hand2的蛋白表達，在心肌發育和抑制心肌肥厚過程中發揮重要功能，伴或不伴糖尿病的心肌肥大患者中miR-1表達均出現異常，表現為明顯下調[12]。本研究首次發現miR-1在驚恐障礙患者血漿中表達明顯下調；同時，我們發現miR-1表達水平與驚恐障礙患者自主神經癥狀和預期性焦慮密切相關，其表達水平越低，患者的焦慮水平及四肢發麻、心慌、胸悶等軀體癥狀越明顯，能在一定程度上成為疾病發生及臨床癥狀嚴重程度水平的預測分子。而miR-1在心肌、骨骼肌組織中特異性表達，與心肌疾病、腫瘤發生的密切相關；研究發現，miR-1表達下調可能誘發心律失常，這與miR-1參與調節內源性鈣離子交換通路基因Stx6有關[13]；因此不排除驚恐障礙可能存在與心律失常、腫瘤等疾病相關或相似的靶基因調控通路，這為驚恐障礙的進一步病理生理機制研究提示了一定線索。

目前認為miR-1能夠引發細胞凋亡，并由此成為化療的潛在靶點[14]。本研究發現miR-1與驚恐障礙藥物治療效果相關聯，經過6周舍曲林治療后患者血漿表達水平明顯降低，這雖然與前述的miR-1在病例組表達水平下調相矛盾，但仍然提示miR-1可能在抗焦慮藥物作用機制中發揮重要作用，也為今后疾病治療藥物的研發提供了一定方向。但由于miR-1的表達亦受到表觀遺傳的修飾作用，例如肺癌細胞中核小體組蛋白超乙酰化可抑制其表達[15]，肝癌細胞中，miR-1-1的CGI甲基化亦會引起miR-1表達受抑制，而miR-1的缺失可引起肝癌相關組蛋白甲基轉移酶G9 a的上調[16]。因此，我們設想本研究發現在治療后miR-1水平反而下降的結果不排除可能在藥物作用過程中可能同時激活了對miR-1產生抑制的表觀遺傳修飾，這亦需要今后進一步擴大樣本以及進行靶基因層面的探討以明確。

本研究存在的局限：由于條件有限，研究樣本量相對偏少，可能對結果的統計效能產生一定影響，但本研究仍揭示了miR-1與驚恐障礙發病及轉歸存在關聯性趨勢，有助于今后大樣本進一步探討。本研究入組患者僅使用舍曲林治療，未能評估其它抗焦慮藥物療效與miR-1表達水平變化之間的關聯性，但單一藥物治療有助于避免不同藥物效應的混雜因素，使得結果更為可靠。今后可進行不同藥物治療分組，探討miRNA表達水平與不同藥物療效之間的相關性。

總之，本研究首次在中國漢族人群中揭示了miR-1與驚恐障礙發病以及療效的關聯性，同時發現該miRNA表達與患者的焦慮水平及自主神經癥狀密切相關，為進一步在分子遺傳學方面探討疾病發生及轉歸提供了一定線索，也有助于今后基于基因表達調控的個體化優化治療方案的開展。