DPP-4基因多態性與大動脈粥樣硬化型腦梗死患者預后的相關性分析

晏 昆，蒙 凌，陳玉芳

(廣州新海醫院神經內科，廣東 廣州 510300)

大動脈粥樣硬化性腦梗死是一種重要的缺血性卒中類型，也是中國死亡和殘疾的重要原因[1，2]。動脈粥樣硬化是腦梗塞的主要病理基礎[3]。炎癥反應可能在動脈粥樣硬化和腦血管疾病的病理機制中發揮重要作用[4]。編碼二肽基肽酶4(Dipeptidyl peptidase，DPP-4)的DPP4基因，也稱為細胞表面抗原CD26，位于染色體2q24.3上，其主要表達于內皮細胞，循環血小板，單核細胞，中性粒細胞和某些T細胞亞群的表面，DPP-4是一種II型跨膜蛋白，通過脫落過程被切割下來并作為可溶形式(sDPP-4)釋放到循環中，具有作為結合和信號蛋白的非酶功能，在炎癥和心血管調節中起作用[5～8]。DPP-4已被證明在炎癥反應中起雙重作用(促炎癥或抗炎癥)。它可以通過整合素的上調介導細胞粘附，在白細胞的跨內皮遷移，抑制T細胞介導的信號轉導和調節血小板功能中起重要作用。另一方面，它可以發揮作用通過增加白細胞活化閾值，抑制促炎細胞因子的產生和維持血管屏障的完整性來實現抗炎作用[9～11]。DPP-4基因多態性(Single nucleotide polymorphisms，SNPs)與許多自身免疫性疾病和炎癥性疾病有關[12]。研究表明，DPP-4基因多態性與巨細胞動脈炎、Behcet有一定程度的相關性[13]。本研究探討DPP-4基因rs1558965、rs1558957位點SNP對大動脈粥樣硬化型腦梗死患者預后的影響，為大動脈粥樣硬化型腦梗死患者預后的治療提供理論及臨床依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料2015年1月至2017年6月我院神經內科住院治療的大動脈粥樣硬化型腦梗死患者110例，均經臨床神經系統檢查，經顱多普勒定義大血管病變，經超聲檢查(TCD)、頸動脈彩色超聲檢查和頭部磁共振血管造影(MRA)、腦CT和/或MRI確診。大動脈粥樣硬化型腦梗死的診斷標準為中國第四次全國腦血管病大會的標準：①顱內外：除穿支動脈疾病區獨立梗死灶外梗死，在顱內、顱外大動脈粥樣硬化區易損板塊狹窄面積≥50%；支動脈疾病區孤立梗死灶類型，影像學檢查穿載體動脈粥樣硬化斑塊或不同程度的動脈粥樣硬化狹窄；非心源性腦梗死；排除其他因素的病因。②主動脈弓：多發性腦梗死病灶，且受累最嚴重部位為雙側前循環及(或)雙側后循環部分存在前后一起發；未檢測為急性多發性腦梗死(血小板缺少、血管炎、腫瘤性栓塞等)；未檢測出心源性腦梗死潛在病因；未發現對應顱內、外LAA病變，易損斑塊狹窄面積≥50%；存在主動脈或腫瘤性栓塞潛在病因，影像學檢測主動脈弓斑塊>4 mm，存在血栓。排除標準：心源性因素引起的腦梗塞、關節炎、血液病、腫瘤或腦血管畸形、腦梗塞后出血、嚴重的肝腎疾病；彌散性血管內凝血、自身免疫性疾病、懷孕。所有受試者均簽署書面知情同意書。

1.2 DPP-4基因多態性多態性檢測DPP-4基因報道SNP位點中本研究選取已證實的性血管疾病相關2個突變位點，分別為rs1558965、rs1558957[14]，具體基因提取方案：肱靜脈抽血4 ml，EDTA-K2抗凝，5000 RPM離心5 min后，去血清加入300 μl人紅細胞裂解液，混勻震蕩3 min，10000RPM離心30 s。為了消除任何懸浮的蛋白質和RNA，使用QIAamp(Qiagen Inc.，Valencia CA)進一步純化所有DNA樣品。簡而言之，將400 μl保存的裂解物置于含有20 μl蛋白酶K的2 ml微量離心管中。然后將管在56 ℃溫育10 min，然后加入400 μl乙醇(96%～100%)。)到樣品。將來自前一步驟的700 μl混合物應用于QIAamp Spin Column并以6000×g(8000rpm)離心1 min。將QIAamp旋轉柱置于干凈的2 ml收集管中，并將濾液安全地丟棄。在重復離心步驟后，將500 μl AW1緩沖液加入到旋轉柱中，并以6000×g(8000 rpm)離心1 min。用AW2緩沖液重復該步驟。在最后一步中，將QIAamp Spin Column置于干凈的1.5 ml微量離心管中，向其中加入150 μl AE緩沖液，然后在室溫下孵育1分鐘，然后以6000×g(8000 rpm)離心1 min。將純化的DNA保存在-20 ℃。通過設計來自多態性位點側翼區域的引物并通過瓊脂糖凝膠上的大小區分正常和突變等位基因來選擇DPP-4多態性。設計DPP-4的引物，并由Invitrogen(中華人民共和國上海)合成。引物序列如下：5’-TGTGAATCCTTTTCCTGCTTTTC-3’(上游引物)；和5’-GCTTGCTATGGAGACCCTGAC-3’(下游引物)。聚合酶鏈式反應(PCR)如下進行，PCR以33 μl的總體積進行(20～60 ng基因組DNA，0.5 U Taq DNA聚合酶，10 pmol每種引物，10 mmol每種dNTP和50 mmol MgCl2。進行反應在96孔GeneAmp?PCRSystem 9700(Applied Biosystems，Foster City，CA USA)。反應條件：在94 ℃預變性5 min；然后進行35個循環的擴增，包括在94 ℃變性20 s，在55 ℃退火35 s，然后在72 ℃延伸35 s；最后在72 ℃延伸10 min。將8微升所得PCR產物用于用限制酶過夜消化，并使用4%瓊脂糖凝膠電泳系統(BMA，Rockland，ME，USA)分析以確定DPP-4等位基因。G→A的變體可導致Nhe I限制性位點的出現，G→C的變體可導致Nhe Ⅱ限制性位點的出現。通過限制性內切核酸酶Nhe I(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA)消化PCR擴增產物，并通過在含有0.5×Tris-硼酸鹽-EDTA緩沖液(115 V，30～40 min)的2%瓊脂糖凝膠上電泳檢測。電泳后，使用基于紫外線的凝膠成像系統觀察和拍攝這些條帶。

1.3 觀察指標觀察DPP-4基因rs1558965(AG+GG、AA)、rs1558957(GG、GC+CC)基因型一般資料，統計其預后情況，并分析不同基因型與預后間相關性。

1.4 統計學方法采用SPSS 19.0軟件處理數據。計量資料比較采用t檢驗或秩和檢驗；計數資料比較采用χ2檢驗；預后分析采用Kaplan-Meier生存曲線，生存期比較采用秩和檢驗；相關性分析采用Pearson相關分析或Spesrman相關分析。P< 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 DPP-4 rs1558965基因位點不同基因型基本臨床資料的比較由表1可見，DPP-4 rs1558965基因位點AA基因型高血壓比例、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL)水平高于AG+GG基因型 (P< 0.05)；而在男性、糖尿病、吸煙史、飲酒史比例分布以及年齡水平比較上，AA基因型和AG+GG基因型相近 (P> 0.05)。

表1 DPP-4 rs1558965基因位點不同基因型基本臨床資料的比較

a與AG+GG組比較，P< 0.05

2.2 DPP-4 rs1558965基因位點不同基因型預后分析由表2及圖1可見，DPP-4 rs1558965基因位點AG+GG組3年生存率及生存期均低于AA組(χ2=17.89，Z=15.642，P< 0.05)。

表2 DPP-4 rs1558965基因位點不同基因型預后分析

圖1 DPP-4 rs1558965基因位點不同基因型預后分析

2.3 DPP-4 rs1558965基因位點不同基因型與預后相關性分析由表3可見，DPP4 rs1558965 AA基因型與大動脈粥樣硬化型腦梗死患者預后有相關性(P< 0.05)，DPP4 rs1558965 AG+GG基因型與大動脈粥樣硬化型腦梗死患者預后無相關性(P> 0.05)。

表3 DPP-4 rs1558965基因位點不同基因型與預后相關性分析

2.4 DPP-4 rs1558957基因位點不同基因型基本臨床資料的比較由表4可見，在男性、高血壓、糖尿病、吸煙史、飲酒史比例分布以及TG、TC、LDL、年齡水平比較上，DPP-4 rs1558957 GG基因型和GC+CC基因型相近，差異無統計學意義(P> 0.05)。

表4 DPP-4 rs1558957基因位點不同基因型基本臨床資料的比較

2.5 DPP-4 rs1558957基因位點不同基因型預后分析由表5及圖2可見，DPP-4 rs1558957 GC+CC 基因型3年生存率及生存期與GG型相近，差異無統計學意義(χ2=0.951，Z=1.369，P> 0.05)。

表5 DPP-4 rs1558957基因位點不同基因型預后分析

圖2 DPP-4 rs1558957基因位點不同基因型預后分析

2.6 DPP-4 rs1558957基因位點不同基因型與預后相關性分析由表6可見，DPP-4 rs1558957 GG、GC+CC基因型與大動脈粥樣硬化型腦梗死患者預后無相關性(P> 0.05)。

表6 DPP-4 rs1558957基因位點不同基因型與預后相關性分析

3 討論

DPP-4是一種130 kDa的免疫球蛋白(Ig)超家族成員，被認為在動脈粥樣硬化的發病機制中起作用，其潛在機制可能涉及炎癥。DPP-4可由CD4 + T細胞亞群，肥大細胞和B細胞分泌，其在控制感染、免疫的信號傳導途徑中起作用。作為炎癥反應的放大器，DPP-4參與許多感染、炎癥疾病，包括過敏性紫癜，支氣管哮喘。DPP-4通過調節整合素介導細胞遷移并刺激整合素激活。一些研究發現DPP-4的多態性與心肌梗塞或急性冠狀動脈綜合征，支氣管哮喘和嚴重瘧疾有關。研究表明，支氣管哮喘患兒外周血單個核細胞DPP-4 mRNA水平上調。活化的DPP-4可通過影響Th1/Th2途徑介導支氣管哮喘的發病機制。此外，DPP-4基因多態性也與廣東人群中的鼻咽癌風險有關。先前已經研究了DPP-4(G2848A)基因多態性在霍奇金淋巴瘤發病機制中的作用，結果表明DPP-4和MyD88的多態性和單倍型與霍奇金淋巴瘤的發生有關。然而，迄今為止的研究很少關注腦梗塞的風險。rs1558965是位于DPP-4基因的密碼子563的外顯子8上的多態性，它導致從天冬酰胺到絲氨酸的變化。其在陽離子結合中起重要作用。通過改變CD31的結構或通過影響Ca2+依賴性細胞相互作用，取代氨基酸可以影響與整聯蛋白的結合親和力；這可能會影響涉及細胞遷移，分化或細胞凋亡的信號通路。本研究結果顯示，DPP-4 rs1558965基因位點AG+GG組3年生存率及生存期均明顯低于AA組，再根據結果進行相關性分析，發現Rs1558965多態性與大動脈粥樣硬化型腦梗死患者預后存在相關性。

研究已證明DPP-4 SNP rs1558965與T2DM相關，并且與sDPP-IV水平的變化相關。血脂異常是T2DM的常見特征，可通過測量載脂蛋白B(ApoB)水平進行定量。最近的一項研究鑒定了南亞人群中與ApoB水平相關的DPP4基因的新SNP，發現 DPP4 rs1558965 AA基因型與ApoB水平顯著相關。這在另一方面也提示，DPP4 rs1558965 AA基因型易導致ApoB水平升高，而ApoB做作為炎癥的預測因子，其代謝水平與多種炎癥標志物如IL-6，腫瘤壞死因子α(TNF-α)和CRP水平的增加有關。因此DPP4 rs1558965 AA基因型引起炎癥因子代謝紊亂這也可能是AA基因型是大動脈粥樣硬化型腦梗死患者不良預后的原因。本研究同時也探討了DPP-4 rs1558957 GG、GC、CC基因型與大動脈粥樣硬化型腦梗死患者預后的相關性，結果發現，DPP-4 rs1558957 GG、GC、CC基因型與大動脈粥樣硬化型腦梗死患者預后無相關性。而這些研究結果的定論需要在排除年齡、性別等混雜因素后才能確定，這將在后續研究中進行。

綜上所述，DPP4 rs1558965 AA基因型與大動脈粥樣硬化型腦梗死患者預后有相關性；DPP-4 rs1558957 GG、GC、CC基因型與大動脈粥樣硬化型腦梗死患者預后的無相關性。本研究仍存在一定不足之處，由于本研究尚處于初步階段，受到時間及樣本數量限制，可能在某些結果統計上產生一定偏差，因此有必要在后續研究中延長時間、擴大樣本量，實施進一步深入研究。