牙釉質仿生再礦化的研究進展

趙華蕾 綜述 楚金普 審校

牙齒的仿生再礦化(biomimetic remineralization)是在天然牙因齲病或其他牙體硬組織疾病而導致牙體硬組織缺損后，根據仿生礦化的原理在脫礦釉質晶體上實現類釉質晶體沉積，并達到與天然釉質相似的形態及功能。牙齒的仿生再礦化包括牙釉質仿生再礦化和牙本質仿生再礦化，兩者因發生機制的不同，其仿生機制也有較大差別。本文就牙釉質仿生再礦化的研究進展作一綜述。

1 牙釉質仿生再礦化的理論基礎

牙釉質的發育過程由成釉細胞形態和功能所定義的預保守、分泌、過渡和成熟4個階段組成[1]。形成釉質精確組織結構的要點不僅是礦化前期成釉細胞的作用，也與被高度控制表達的蛋白質和酶類有關，這些有機細胞外基質成分(如釉原蛋白，釉蛋白，成釉蛋白)均可通過與細胞以及形成的礦物相互作用而發揮功能[2]。

關于釉質晶體的結晶過程，目前有經典結晶理論與非經典結晶理論2種假說。上世紀九十年代，學者們通過對晶體成核過程中動力學機制的研究推測：結構化的有機表面在有機基質介導的礦物沉積中，可通過界面識別作用降低特殊晶體面和多晶型的成核活化能，從而抑制特殊晶體面礦物成核，并進而促進晶體的定向生長、延長；即經典結晶理論[3-4]。但該理論僅能用來解釋表面結構良好單晶體的繼續生長，不適用于晶體在基質時期從無到有的早期發生過程[5]。

近些年，學者們又根據礦化過程中有機-無機界面結構及其相互作用強度的研究結果，推測早期無定形納米粒子的轉換，可通過聚集物定向調控而產生晶體學定向混合納米結構；而定向成核和生物礦物的早期生長，則可能是通過無定形相中尺度的轉換和分子機制調節而共同完成的[4]，并將其稱之為-非經典結晶理論。在釉質晶體的發生發展中，非經典結晶理論認為，有機基體與無機過渡相結合形成釉晶體。基于非經典結晶理論，并通過對釉基質蛋白以及晶體礦物形成的研究，學者們提出了釉質形成模型。該模型將基因表達與細胞外蛋白基質的組裝聯系起來，并根據釉原蛋白的功能性結構[6-8]，無定形磷酸鈣納米球結構和排列規律[9]，以及體外結晶實驗[10]等基礎研究結果，推測細胞外基質引導的釉質晶體生物礦化過程為：礦物離子聚集形成礦物成核前體-無定形磷酸鈣(amorphous calcium phosphate，ACP),ACP經細胞外基質蛋白穩定后再排列成平行排列的線性鏈；隨后，ACP融合形成針狀礦物粒子并互相結合形成束狀結晶，從而形成了納米尺度下的釉質標志性結構組織[10]；待釉質晶體生長至一定長度后，蛋白水解酶便會逐漸水解晶體間的細胞外基質蛋白，以促進晶體增厚、成熟[11]。

目前對于仿生再礦化機制以及材料的研究方法，大多是基于非經典結晶理論來構造以釉質細胞外基質蛋白和礦物成核前體ACP為主的釉質形成模型，即通過蛋白的超分子自組裝、穩定Ca-P簇、引導其排列成線性鏈的釉質重建機制重建釉質。

2 釉質仿生再礦化

2.1 釉原蛋白及其衍生物

2.1.1 釉原蛋白 釉原蛋白(amelogenin)是釉質基質蛋白的主要成分，是釉質發育過程中主要的功能性蛋白，屬于內在無序化結構蛋白(intrinsically disordered/unstructured protein family,IDPs)。IDPs是一種通常以非折疊狀態存在的蛋白，也能轉換成折疊狀態，它們的共同特征是與不同分子相互作用時采用不同結構[11]。這種不穩定的構象賦予了釉原蛋白在釉質形成過程中自組裝成納米球的能力，以及與釉基質蛋白、磷酸鈣、細胞受體等相互作用的能力[1，8，12]。釉原蛋白對釉質組織的棱柱狀結構、釉質晶體尺寸的控制以及釉質晶體的定向延長和釉質厚度的調控具有至關重要的作用[13]。在早期體外實驗中，使用掃描電鏡觀察到釉原蛋白能夠在礦化溶液中生成顯微條帶狀的磷灰石晶體[14]。目前認為，釉原蛋白的N末端與釉質形成階段的鈣磷相互作用，C末端參與指導構成高度有序平行排列的羥磷灰石晶體。釉原蛋白功能端基團和羥基磷灰石(HA)和晶體結合位點的靜電吸附作用，是釉原蛋白指導HA晶體再礦化的關鍵步驟[15]。釉原蛋白N末端的磷酸基團在釉質發生過程中也能夠使釉原蛋白發生構象變化，從而影響釉原蛋白與晶體的相互作用[16-17]。Le Norcy 等[18]合成了一種釉原蛋白有機替代物—(lecucine-rich amelogenin peptide, LRAP)，是釉原蛋白主要功能段剪接形成的多肽，不僅能夠代替釉原蛋白發揮作用，其小分子量的特點也避免了其余非功能片段可能存在的免疫原性。Kwak等[19]證明了LRAP能夠代替釉原蛋白完成牙釉質仿生再礦化，形成結構相似的類釉質晶體。

2.1.2 多肽 在牙釉質的仿生再礦化研究中，多肽的出現主要是基于蛋白質的功能片段，通過對功能蛋白片段的人為修正或互相連接，可最終形成具有與蛋白質相似功能的小分子片段。釉原蛋白的自組裝機制涉及雙極性蛋白的主要結構-釉原蛋白納米球表面獨特的親水C末端“尾”, 被認為是釉質形成過程中能將ACP轉化為HA晶體的重要功能基團[20]。Li等[21]利用釉原蛋白的親水C末端氨基酸殘基(-Thr-Lys-Arg-Glu-Glu-Val-Asp)和硬脂酸(C18H35COOH)衍生物合成了兩親性寡肽，并證明這種兩親性寡肽具有與釉原蛋白相似的功能，即能夠在鈣離子和中性溶液環境中自組裝成納米纖維；使ACP在納米纖維表面沉積，并進而形成相對穩定的納米-ACP復合前體；通過誘導緊密排列的束狀釉質樣HA納米棒在脫礦釉質晶體上沉積，而增強釉質的表面硬度。

合成的小分子多肽(P11-4)能在特定環境觸發下通過分子間氫鍵和某些側鏈的共同作用，而分層組裝形成纖維骨架。Kind等[22]研究發現，P11-4雖然能促進釉質表層下礦物質沉積礦化，但其纖維周圍重新形成的HA晶體呈切線狀排列，形成扇形結構，與天然形成的棱柱狀平行排列的HA晶體有較大差別。

通過噬菌體表面技術及細菌表面技術將有機和無機表面結合，可以產生無機結合肽，即HA6-1，其可與釉質HA晶體表面緊密結合。 Xiao等[20]將釉原蛋白C末端的16個氨基酸和HA6-1通過連接肽結合，產生了一種新型嵌合肽，雖其不具有釉原蛋白及其他多肽的自組裝過程，但仍能與釉質HA晶體面結合，同時將ACP轉化為釉質樣磷灰石晶體并沉積在酸蝕釉質晶體上，從而達到快速仿生再礦化。

除釉原蛋白外，在其他來源的蛋白中也有些類型的多肽能與釉質HA表面結合，如唾液磷蛋白和牙本質磷蛋白等。富酪蛋白(statherin)是一種小分子量的酸性唾液磷蛋白，具有唾液磷蛋白的典型功能，即通過-抑制磷酸鈣鹽的沉積，而維持唾液中鈣磷離子飽和度的相對穩定。一種基于富酪蛋白N端初始六肽序列的半胱氨酸標記肽，對牙釉質具有很強的吸附能力，Wang等[23]修正了從富酪蛋白中提取的自然序列，使之形成了具有雙官能團的多肽—DE-11；實驗證實，DE-11能通過富酪蛋白N末端的6氨基酸殘基對釉質HA緊密吸附，并通過一個由多個谷氨酸組成的延伸尾部誘導鈣離子的再礦化，證明DE-11在體外具有促進HA結晶和人工釉質齲再礦化的潛力。

此外，學者們還通過大量的基礎及臨床試驗證實，酪蛋白磷酸肽(casein phosphopeptide,CPP)對于早期釉質損傷具有再礦化作用，含無定形磷酸鈣ACP的CPP-ACP復合物產品已廣泛用于臨床試驗。但Xiaotong等[24]通過系統性回顧及數據分析，認為目前仍缺乏證據支持CCP-ACP凝膠對于早期齲壞、正畸后白堊斑的治療效果優于常規含氟制劑，且含氟CPP -ACP與非氟化CPP ACP的應用存在差異。

2.2 細胞外基質類似物

基于分泌期和形成期的釉基質具有一致的凝膠樣形態，Busch[25]首先采用明膠和鈣磷離子來模擬類凝膠的微環境，以誘導釉質氟磷灰石在人牙釉質上形成。瓊脂是一種非離子型多糖，含有少量的氨基酸，可作為蛋白質和離子的加載-釋放系統[26]。Cao等[26]通過氟磷酸溶液在酸蝕后的釉質切片上建立了四層瓊脂糖水凝膠鈣磷礦化的模型，電鏡下觀察顯示，釉質模型存在沿C軸方向緊密平行排列的氟化羥磷灰石晶體。

牙釉質基質衍生物(EMD)是細胞外基質的主要組成成分-釉基質蛋白的產物，目前被廣泛用于牙周組織再生。瓊脂糖加載釉基質衍生物，與鈣磷氟等離子共同作用，可再生出致密度、厚度、有序及結晶程度均有提高的棒狀氟化HA晶體[27]，再生晶體的彈性模量和顯微硬度相比于對照組也有明顯提高。

Ruan 等[28]開發了一種含氨基的殼聚糖水凝膠，即釉原蛋白-殼聚糖水凝膠(Amelogenin-Chitosan Hydrogel，CS-AMEL)，通過凝膠中釉原蛋白的超分子自組裝，穩定鈣磷簇，將其排列成線性鏈，從而達到釉質仿生再礦化的效果，在電鏡下觀察到新生的柱狀HA晶體，且釉質樣本的硬度及彈性模量也分別增加了9 倍和4 倍；該殼聚糖水凝膠還能抑制細菌生長，有效防齲[29]。Zaharia等[30]建立了釉基質蛋白和殼聚糖凝膠(CS-EMD)釉質再礦化模型，通過對新生類釉質層納米形態、鈣磷比、晶格參數及顯微硬度的分析認為，在CS-EMD系統中，殼聚糖導致了晶體主要的形態學變動和晶格參數的微小改變，并保存了晶體的C軸取向。 Prajapati等[31]在CS-AMEL系統中引入了基質金屬蛋白酶MMP20，發現其抑制了新生晶體間的蛋白堵塞，提高了再礦化類釉質晶體層的機械性能。

水凝膠的引入促進了蛋白和多肽等仿生材料的臨床應用，不僅使形成的再礦化晶體與原釉質的結合更牢固、結構更致密，同時還實現了在類似細胞外基質的環境中對礦物離子的部分調控能力。但是水凝膠系統完成仿生再礦化所需周期較長，且形成的晶體間殘留有蛋白和凝膠，影響了再礦化晶體的機械性能。

2.3 聚合物

2.3.1 合成聚合物 在許多負責HA礦化的大分子中都存在羧酸和磷酸基團，在特殊的蛋白及生物環境中，這些基團可以形成微晶，對晶體生長分別產生抑制或促進作用。除磷酸絲氨酸和天冬氨酸外[32]，Li等[33-34]研究證實，谷氨酸和天冬氨酸能夠吸附在酸蝕釉質晶體表面，定向排列束狀類釉質晶體層。Wang等[35]利用羧甲基殼聚糖(carboxymethyl chitosan，CMC)的羧基螯合作用以穩定ACP，并同時引入阿倫膦酸鹽(alendronate，ALN)和甘氨酸來進行釉質再礦化實驗；結果顯示， ALN對釉質的特異性吸附能增強礦化劑與牙釉質表面的結合強度，形成定向而有序排列的束狀羥基磷灰石晶體。

2.3.2 聚酰胺-胺型樹枝狀分子(PAMAM) PAMAM被稱為人工蛋白, PAMAM能夠自組裝成與釉原蛋白行為相似的纖維條帶狀結構, Chen等[36-37]通過在PAMAM上加載羧基基團(-COOH)而形成了PAMAM-COOH聚合物, 并在體外酸蝕釉質晶體上形成了排列良好的棒狀晶體。Wu等[38]又在PAMAM-COOH聚合物的基礎上通過加載酸性官能團ALN而形成了ALN-PAMAM-COOH聚合物，以利用ALN對釉質的特異性吸附作用，增強PAMAM對釉質的結合力；該研究經體外實驗發現，在人工唾液中ALN-PAMAM-COOH能誘導HA在人牙釉質晶體表面進行原位再礦化，并可使其顯微硬度恢復至原釉質晶體的95.5%；在小鼠口腔內ALN-PAMAM-COOH能誘導HA再生。Chen等[39]研究認為，PAMAM還能通過其表面基團的不同，修飾調控HA的大小和形狀； 此外，使用磷酸二甲酯(dimethyl phosphate)修飾第4代PAMAM而形成了低細胞毒性的PAMAM-PO3H2聚合物，經體外實驗發現，在人工唾液中，PAMAM-PO3H2能誘導HA形成有序定向排列的HA晶體，且新生晶體多數與原牙釉質表面垂直；動物實驗中也獲得了類似結果。

2.3.3 殼聚糖(Chitosan) 殼聚糖是由隨機分布的β-(1-4)-D-氨基葡萄糖(去乙酰基)和N-乙酰-D-氨基葡萄糖(乙酰化)組成的線性多糖。這種可生物降解的、對人免疫系統無毒的物質已經被廣泛的用于牙科材料防齲，牙骨整合和骨植入物的生物活性涂層生長以及傷口愈合過程中的殺菌或抑菌作用。目前認為殼聚糖主要通過以下幾方面促進再礦化：①通過螯合作用穩定鈣離子，并進而形成晶體成核位點；②深入表層下病灶區，并與帶負電的磷灰石晶體表面結合；③抑制自發性礦物沉淀，有利于形成長期而完整的表層下礦化；④其衍生物可促進非晶體磷酸鈣轉化成釉質類晶體[40-42]。Arnaud等[43]分析證實，殼聚糖具有抑制牙釉質脫礦的作用，可作為釉質的抗酸屏障；除此之外，殼聚糖還具有向釉質表層下滲透的能力，其濃度為2.5、 5 g/ml時能夠達到釉牙本質界。目前在釉質仿生再礦化領域對于殼聚糖的應用，主要集中于利用殼聚糖形成合成復合物(如模擬磷酸化蛋白作用的磷酸鹽殼聚糖Pchi)[42]或將殼聚糖與其他含蛋白的仿生再礦化材料聯合使用(如CS-Ame水凝膠，CS-EMD水凝膠等)，以達到釉質晶體的仿生再礦化的效果。

3 小 結

天然牙釉質的形成是一個復雜而又精密的相互作用過程，基于牙釉質的仿生再礦化，為脫礦釉質甚至部分缺損釉質的晶體重建提供了新的思路，并可使新沉積的晶體具有良好的釉質樣層次結構和化學性能。無論是釉原蛋白、多肽、細胞外基質類似物，還是PAMAM、殼聚糖，這些材料在釉質仿生再礦化過程中，都具有幾個共同特點：①穩定溶液中的鈣磷離子，抑制早期自發沉淀；②能與ACP結合形成納米聚合物，且對釉質HAP晶體面有高親和力；③為新生晶體提供成核位點或礦化模板，以控制晶體的有序形成。目前對于釉質仿生再礦化材料是否有效的評定標準，多是通過觀察電鏡下是否有類似天然釉質晶體的新生晶體定向有序生成。

目前的仿生再礦化研究大多仍停留在體外實驗階段，因其實驗要求高，周期較長，且缺少口腔內復雜生物環境的干預，新形成晶體的致密度、純度與天然釉質還是有一定差距，在機械性能方面也有所欠缺；對于新生晶體的生長速度、力學性質也缺乏進一步的研究及論證。牙釉質的仿生再礦化，最終目標是能夠形成具有天然牙釉質生物特性的釉質晶體。在以后的研究中，仍需大量的臨床實驗來驗證仿生再礦化材料在口腔內環境中的性能及礦化效果。