自噬在胰島β細(xì)胞存活中的作用及游離脂肪酸對其調(diào)控的分子機(jī)制研究進(jìn)展

馮曉桃，段慧明，程永芳

(1廣西中醫(yī)藥大學(xué) 廣西中醫(yī)基礎(chǔ)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧530200；2廣西中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心)

2型糖尿病(T2DM)已成為嚴(yán)重威脅人類健康的公共衛(wèi)生問題之一?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究認(rèn)為，除外胰島素抵抗，胰島β細(xì)胞進(jìn)行性衰竭在T2DM發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用。因此，保護(hù)和促進(jìn)胰島β細(xì)胞存活成為防治T2DM的重要策略。T2DM往往伴有脂質(zhì)代謝紊亂，表現(xiàn)為高游離脂肪酸(FFA)血癥[1]。高水平FFA不僅能夠通過抑制胰島素信號通路如磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)信號通路，進(jìn)而抑制胰島素靶組織對葡萄糖的攝取和利用，引起胰島素抵抗[2,3]，而且還損傷胰島β細(xì)胞，甚至導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[4]。同時(shí)，F(xiàn)FA還誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞產(chǎn)生自噬，保護(hù)細(xì)胞免受損害[5]。因此，研究FFA調(diào)控胰島β細(xì)胞自噬的分子機(jī)制有助于促進(jìn)保護(hù)胰島β細(xì)胞的藥物研發(fā)。現(xiàn)將自噬在胰島β細(xì)胞存活中的作用及FFA對其調(diào)控的分子機(jī)制研究進(jìn)展綜述如下。

1 自噬在維持胰島β細(xì)胞存活中的作用

1.1 自噬流及其調(diào)控機(jī)制 自噬是真核細(xì)胞借助溶酶體降解其胞質(zhì)蛋白、細(xì)胞器等成分，從而維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的一個(gè)調(diào)控過程。當(dāng)細(xì)胞感受到自噬信號，如饑餓、缺氧、外界壓力、細(xì)胞器損傷、微生物感染等，細(xì)胞就會在胞質(zhì)內(nèi)形成一膜狀結(jié)構(gòu)，并不斷擴(kuò)張，逐漸形成新月形的脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)，即自噬泡；自噬泡不斷延伸，并將其周圍的細(xì)胞器如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體等物質(zhì)成分包裹，形成環(huán)狀雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬體；自噬體隨后與溶酶體結(jié)合形成自噬溶酶體，溶酶體酶隨之將包裹的內(nèi)容物降解，并產(chǎn)生氨基酸、脂肪酸等，供細(xì)胞利用。在此過程中，自噬泡和自噬體是產(chǎn)生自噬的形態(tài)學(xué)特征；同時(shí)，胞質(zhì)內(nèi)微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(LC3)經(jīng)酶解作用形成胞質(zhì)型LC3-Ⅰ，然后轉(zhuǎn)變?yōu)槟ば蚅C3-Ⅱ，定位于自噬體膜上，成為自噬的生化標(biāo)志。事實(shí)上，自噬過程(即自噬流)受自噬相關(guān)基因(ATG)嚴(yán)密調(diào)控。在自噬的起始階段，ATG1能募集ATG11、ATG13、ATG17等形成復(fù)合物，從而誘發(fā)自噬；隨后形成ATG12-AGT5-AGT16L1多聚體，促進(jìn)LC3蛋白轉(zhuǎn)變和定位;同時(shí)AGT6(Beclin-1)與ATG14等一起作用于經(jīng)典的Ⅲ型PI3K，促進(jìn)形成自噬體膜和自噬體；而ATG2-ATG9-ATG18復(fù)合物形成則調(diào)控著ATG蛋白從成熟自噬體分解，并再循環(huán)利用[6]。

另外，自噬流還受其上游信號通路所調(diào)控。在這些信號通路中，哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是其關(guān)鍵的負(fù)性調(diào)控激酶，受Ⅰ型PI3K/Akt信號通路和絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)/胞外信號活化激酶1/2(ERK1/2)信號通路激活而抑制自噬流，被AMP活化蛋白激酶(AMPK)信號通路和p53信號轉(zhuǎn)導(dǎo)所抑制而促進(jìn)自噬。此外，AMPK信號通路和Ⅲ型PI3K信號通路還可以通過不依賴于mTOR就能誘發(fā)自噬。活化的mTOR能夠磷酸化ULK1(ATG1同源類似物)的Ser757位點(diǎn)，并破壞AMPK與ULK1之間的聯(lián)系，抑制自噬信號；相反，在營養(yǎng)不足的情況下，AMPK能夠直接作用于ULK1，導(dǎo)致ULK1多個(gè)位點(diǎn)磷酸化，包括Ser317和Ser777，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞自噬。

1.2 自噬與胰島β細(xì)胞的關(guān)系 自噬在細(xì)胞生長、發(fā)育和老化等過程中都起著重要的作用。適度自噬可以更新細(xì)胞器和蛋白質(zhì)，從而維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定；而且，自噬產(chǎn)生的氨基酸、脂肪酸等物質(zhì)又可以重新被利用，提供能量。自噬作為細(xì)胞的一種防御機(jī)制，可以清除應(yīng)激狀態(tài)下受損的細(xì)胞器和蛋白質(zhì)，進(jìn)而保護(hù)細(xì)胞免受損害和維持細(xì)胞存活。研究表明，自噬對于維持胰島β細(xì)胞數(shù)量、結(jié)構(gòu)和功能是必不可少的。胰島β細(xì)胞缺乏自噬功能可導(dǎo)致細(xì)胞增殖能力下降、死亡增加、體積減少、胰島素含量下降和葡萄糖刺激胰島素分泌減少以及機(jī)體高血糖、糖耐量損傷和低胰島素血癥[5,7]，而維持自噬功能可以保護(hù)胰島β細(xì)胞免受內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等所介導(dǎo)的細(xì)胞損傷[8]。

2 FFA調(diào)控胰島β細(xì)胞自噬的分子機(jī)制

2.1 FFA對胰島β細(xì)胞mTOR依賴性信號通路的影響 長期高水平FFA促使胰島β細(xì)胞產(chǎn)生自噬，表現(xiàn)為細(xì)胞自噬泡和自噬體顯著增加，LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)升高以及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ值增大。進(jìn)一步研究顯示，飽和脂肪酸棕櫚酸(PA)能夠顯著抑制胰島β細(xì)胞mTOR、Akt和ERK磷酸化，而對mTOR和ERK蛋白表達(dá)無明顯影響[9～11]。抑制mTOR、Ⅰ型PI3K或Akt活性可以進(jìn)一步提高PA誘導(dǎo)的自噬水平，并預(yù)防其誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[9,11]。但也有報(bào)道發(fā)現(xiàn)，PA能夠提高胰島β細(xì)胞Akt和mTOR磷酸化水平，從而激活mTOR信號通路，抑制自噬轉(zhuǎn)化，進(jìn)而提高自噬體和自噬底物表達(dá)水平，而抑制mTOR顯著降低了PA誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[12]。

2.2 FFA對胰島β細(xì)胞非mTOR依賴性信號通路的影響 在胰島β細(xì)胞NIT-1中，PA能夠提高其自噬水平，但細(xì)胞AMPK蛋白表達(dá)及其磷酸化水平卻下降，而mTOR蛋白表達(dá)則升高，表明脂肪酸可以通過非mTOR途徑調(diào)控胰島β細(xì)胞自噬[13]。

2.2.1 FFA通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞自噬 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的特點(diǎn)是細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)未折疊或錯誤折疊蛋白集聚。未折疊或錯誤折疊蛋白增多可被內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的感應(yīng)器包括蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(PERK)、肌醇需求酶1α(IRE1α)和轉(zhuǎn)錄活化因子6(ATF6)所感知，觸發(fā)了未折疊蛋白反應(yīng)(UPR)。活化的PERK磷酸化真核起始因子2α(eIF2α)，從而減少蛋白質(zhì)合成，減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)負(fù)擔(dān)，并提高ATF4翻譯；IRE1α活化則提高X盒結(jié)合蛋白1(XBP1)翻譯；而ATF6在高爾基水解后釋放活性轉(zhuǎn)錄因子和促進(jìn)XBP1轉(zhuǎn)錄。這些活性轉(zhuǎn)錄因子能夠增加伴侶蛋白和蛋白折疊酶的合成，誘導(dǎo)未折疊、錯位折疊蛋白降解。因此，適度UPR有利于維持細(xì)胞存活和生理功能。但當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)處理蛋白能力下降，或未折疊/錯誤折疊蛋白過度集聚，超過了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自身處理能力時(shí)，適度UPR就會向凋亡式UPR轉(zhuǎn)變，引起細(xì)胞凋亡。胰島β細(xì)胞富含內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，蛋白合成與分泌十分活躍，容易誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。事實(shí)上，T2DM患者胰島存在明顯的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。研究顯示，高水平PA能誘發(fā)胰島β細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[14]，并通過C/EBP同源蛋白(CHOP)實(shí)現(xiàn)了適度UPR向凋亡式UPR轉(zhuǎn)變[15～17]。活化的CHOP能夠下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2/Bcl-XL表達(dá)，而上調(diào)促凋亡蛋白Bax表達(dá)，繼而激活凋亡執(zhí)行蛋白Caspase-3，導(dǎo)致胰島β細(xì)胞凋亡[4,18]。此外，PA在誘導(dǎo)INS-1細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的同時(shí)還伴有Beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)升高[19]。高脂飲食也能夠提高大鼠胰島細(xì)胞Beclin-1蛋白表達(dá)和降低Bcl-2/Bcl-XL蛋白表達(dá)[20]。研究已表明，Bcl-2/Bcl-XL能夠作用于Beclin-1，進(jìn)而抑制自噬。一方面，Bcl-2/Bcl-XL蛋白表達(dá)下降解除了其對Beclin-1的抑制；另一方面，高表達(dá)的Beclin-1又能夠掙脫低表達(dá)的Bcl-2/Bcl-XL蛋白控制，進(jìn)而促進(jìn)自噬。此外，F(xiàn)FA還能通過激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激下游的c-Jun氨基末端激酶(JNK)信號通路，進(jìn)而抑制PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，促進(jìn)胰島β細(xì)胞自噬[9,18,21]。而且，活化的JNK還能夠磷酸化Bcl-2，抑制Bcl-2和Beclin-1之間的作用，促使Beclin-1釋放[22]，誘發(fā)自噬。抑制JNK可解除PA對Akt磷酸化的抑制，進(jìn)而減少自噬[9]。研究表明，增強(qiáng)自噬可以降低胰島β細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，減少細(xì)胞凋亡[23]；而通過敲除Beclin-1或ATG5抑制自噬則增強(qiáng)了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[24]?？梢?，脂肪酸誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞產(chǎn)生自噬至少部分是細(xì)胞對其誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等損害所作出的一種防御性反應(yīng)，以清除未折疊、錯誤折疊蛋白以及衰老、受損的細(xì)胞器，從而維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。

2.2.2 FFA通過氧化應(yīng)激誘發(fā)胰島β細(xì)胞自噬 氧化應(yīng)激是機(jī)體受到刺激，體內(nèi)氧化和抗氧化能力失衡，活性氧簇(ROS)、氮簇或自由基等產(chǎn)生增多，超出了自身清除能力，導(dǎo)致組織和細(xì)胞發(fā)生氧化損傷的病理過程。ROS包括超氧陰離子(O2-)、過氧化氫(H2O2)和羥基(HO-)。胰島β細(xì)胞產(chǎn)生ROS有線粒體和非線粒體途徑。在線粒體內(nèi)，電子流通過電子傳遞鏈并依賴線粒體內(nèi)膜4個(gè)酶復(fù)合物、細(xì)胞色素C(Cyt C)和移動載體輔酶Q進(jìn)行傳遞。在傳遞過程中，O2-主要依靠復(fù)合物Ⅰ和Ⅲ產(chǎn)生。O2-不具有膜滲透性，但非?；钴S，能夠在超氧化物歧化酶(SOD)作用下轉(zhuǎn)變?yōu)镠2O2。H2O2是一非極性、能通過水孔蛋白自由擴(kuò)散的小分子，活性明顯小于O2-，并在外部刺激下迅速合成和消失。H2O2在過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)和過氧化物氧化還原酶(Prx)的作用下，最終被催化成為氧氣(O2)和水。在線粒體外，磷酸煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADPH)氧化酶能夠?qū)㈦娮愚D(zhuǎn)運(yùn)到O2，觸發(fā)產(chǎn)生ROS。此外，胞質(zhì)中多個(gè)氧化還原酶也能催化產(chǎn)生ROS。研究發(fā)現(xiàn)，胰島β細(xì)胞胞質(zhì)和線粒體SOD水平是肝臟的50%，而CAT、GPx僅是肝臟的1%，表明胰島β細(xì)胞抗氧化能力不足，容易發(fā)生氧化應(yīng)激。事實(shí)上，T2DM患者胰島細(xì)胞確實(shí)存在氧化應(yīng)激和細(xì)胞損傷[25]。長期高水平FFA通過線粒體途徑和NADPH氧化酶途徑誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞氧化應(yīng)激，產(chǎn)生大量ROS，包括H2O2和O2-，同時(shí)伴有Bcl-2蛋白表達(dá)下降和Caspase-3活性升高以及明顯的細(xì)胞凋亡。抑制氧化應(yīng)激進(jìn)而減少ROS產(chǎn)生可以維持Bcl-2蛋白表達(dá)和抑制Caspase-3活性，從而減輕細(xì)胞凋亡。研究表明，Bcl-2能夠調(diào)控ROS信號途徑，抑制Bcl-2能夠促進(jìn)線粒體質(zhì)子滲漏和SOD活性，提高ROS水平[26]，導(dǎo)致氧化應(yīng)激的惡性循環(huán)。因此，脂肪酸可通過誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞氧化應(yīng)激，降低Bcl-2表達(dá)，進(jìn)而減少Bcl-2和Beclin-1之間的作用，實(shí)現(xiàn)對自噬的調(diào)控[4,19]。此外，ROS能滲透到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，觸發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[27]，進(jìn)而誘導(dǎo)自噬[19,28]。據(jù)報(bào)道，PA通過激活氧化應(yīng)激以及隨后的JNK和p38MAPK信號通路促進(jìn)了心肌H9C2細(xì)胞自噬，抗氧化應(yīng)激可以抑制JNK和p38MAPK活性以及細(xì)胞自噬，而抑制JNK或p38MAPK活性則減少了自噬[29]。

2.2.3 其他 在敲除了CHOP進(jìn)而抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的胰島β細(xì)胞，PA誘導(dǎo)的JNK磷酸化水平并未完全受抑制[15]，而體內(nèi)敲除CHOP也未明顯影響JNK活性[17]。這些表明，JNK活化存在著非內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激依賴性途徑。進(jìn)一步研究顯示，PA能夠促進(jìn)雙鏈RNA依賴性蛋白激酶(PKR)磷酸化，進(jìn)而激活JNK1[30]?；罨腏NK磷酸化Bcl-2，進(jìn)而干擾Bcl-2和Beclin-1之間的作用，誘發(fā)自噬[24,30]。相反，抑制JNK活性則阻斷了PA誘導(dǎo)的胰島β細(xì)胞自噬[30]。此外，PA誘導(dǎo)的自噬可以被Ⅲ型PI3K抑制劑所抑制[11,31]，表明PA可以通過Ⅲ型PI3K信號通路調(diào)控胰島β細(xì)胞自噬。

綜上所述，自噬在維持胰島β細(xì)胞存活與功能中起著重要的作用，F(xiàn)FA可誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞產(chǎn)生自噬。因此，闡明FFA調(diào)控胰島β細(xì)胞自噬的分子機(jī)制將為開發(fā)保護(hù)和促進(jìn)胰島β細(xì)胞存活的藥物提供潛在的作用靶點(diǎn)。FFA可通過mTOR依賴的PI3K/Akt和ERK信號通路以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、氧化應(yīng)激途徑、PKR/JNK信號通路和Ⅲ型PI3K信號通路誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞自噬。盡管如此，F(xiàn)FA調(diào)控胰島β細(xì)胞自噬的分子機(jī)制尚未完全清楚。一方面，F(xiàn)FA能夠改變細(xì)胞膜脂質(zhì)構(gòu)成，而磷酸肌醇結(jié)合蛋白涉及到自噬，那么胞膜脂質(zhì)成分的改變是否會影響到磷酸肌醇結(jié)合蛋白進(jìn)而調(diào)控自噬呢？這需要進(jìn)一步研究。另一方面，F(xiàn)FA作為一種能量物質(zhì)，在細(xì)胞內(nèi)能夠代謝生成ATP供細(xì)胞利用。但據(jù)報(bào)道，在PA孵育的人胰島內(nèi)ATP水平是下降的[12]，而AMPK表達(dá)及其活性卻下降或無改變[12,13,30]；胰島β細(xì)胞在缺乏營養(yǎng)時(shí)，自噬受到抑制。因此，有必要明確FFA是否改變了胰島β細(xì)胞能量代謝，進(jìn)而影響到自噬。