3D生物打印藥物篩選生理病理模型平臺建立的研究進展＊

陳紹華，徐 浩，王擁軍，梁倩倩＊＊

（1. 上海中醫藥大學附屬龍華醫院 上海 200032；2. 上海中醫藥大學附屬龍華醫院天山分院 上海 200051）

新藥研發需要很長的時間周期和大量資金的投入[1]。高通量藥物篩選是新藥研發的重要方法，該方法縮短了新藥的研發周期，降低了成本；同時藥篩模型可以重復應用，節省了資源；但也存在著不足，現有大多數平臺都是使用2D 培養法，主要從分子、細胞水平進行藥物篩選，不能體現各細胞以及細胞和細胞外基質之間的關系，不能體現藥物在體內的吸收、分布、代謝及排泄等過程。于是，3D 細胞培養系統應運而生，它能模仿體內各級組織結構的組成，相比于2D 模型更加接近體內的狀態，3D體外模型正在成為傳統的2D 模型和體內動物模型之間的橋梁[2]。3D 模型可以逼真的模仿天然組織，提高了藥物發現過程中尋找候選藥物的藥效和毒副作用的能力，極大地提高了藥篩的進程，加快了新藥進入臨床應用的速度。然而，3D模型的體外制造仍然是3D 模型建立的瓶頸，而3D 打印制造技術的出現和快速發展將有助于我們去突破這個瓶頸。

3D打印制造技術正快速地向生物醫學領域滲透。從第一臺3D 生物打印機問世，在過去短短8年時間里取得了快速發展。PENG W 等人就曾撰文指出3D 打印相關組織模型的可能性，認為這項新技術在建立生理病理體外模型和高通量藥物篩選中具有巨大的潛力和發展前景[3]。伴隨著生物打印技術的革新，以及生物打印材料的不斷進步，其在組織工程學、藥物研發以及再生醫學領域發展迅速。3D 生物打印技術是基于全面收集的被打印組織的數據，通過計算機軟件分析建立三維模型，通過3D 生物打印機裝配特制的生物墨水，最終打印制造出人造組織、器官和其它生物醫學產品的新科技手段[4]。它是生物材料和活細胞在指定的組織中同步定位、逐層堆疊，進行3D 結構的制造，并且在活細胞、蛋白質、DNA 及生長因子等生物活性物質的時空定位上具有很高的精度，可以誘導組織的生成和形成。細胞可以直接使用打印機流體分配裝置打印，或者直接打印出生理病理的相關組織模型，甚者直接細胞書寫（DCW）創建一個3D 仿生微型器官，這在體外建模和高通量藥物篩選中具有深刻的意義[5-8]。這些小型化系統已成為極具吸引力的組織工程和藥篩的應用程序[9]。體外系統的3D 生物打印可以模擬制造出復雜的仿生器官和生理反應模型，并通過精確地操控細胞和它們的微環境來測試藥物，它將更容易將機械和電子元件、數字芯片結合，以便商業化的自動大規模生產[10]。藥物篩選模型的制備就是應用特定的生物墨水，通過排列組合或者相應影響因素的作用下，打印出直接或間接的生理、病理模型，用于研究在復雜環境下干細胞的分化和高通量藥物篩選測試[11,12]。

1 生物墨水、生物打印方式的探索研究

提到3D 生物打印模型平臺建立的過程，就不得不提生物墨水，生物墨水通常由細胞、聚合物和添加劑組成的細胞懸浮溶液。目前可應用于有效3D 打印的生物墨水相對匱乏，仍然是制約3D 生物打印快速發展的瓶頸，因此，在開發用于3D 生物打印的生物墨水方面同樣有大量工作要做。目前常用的生物墨水主要有細胞聚集物（組織球體、細胞顆粒和組織鏈）、微載體、脫細胞基質成分、纖維蛋白、膠原、透明質酸、聚己內酯、聚乙二醇、各種類型水凝膠、藻酸鹽等，雖然其通用性優良，但是針對特定細胞并誘導分化還相對局限[13-24]。目前3D 生物打印有兩種方式，分別為基于支架的生物打印和無支架的生物打印。支架生物打印在藥物的傳遞研究及干細胞生物打印中是首選方法，目前常用的支架材料包括脫細胞的細胞外基質和大量的天然或合成聚合物，具有廣泛的機械、生物相容性。LEE H 等人開發了一種用于3D 生物打印的肝臟脫細胞細胞外基質（dECM）的生物墨水，并評估了其特性：通過適當的印刷參數，驗證印刷過程的通用性和保真度；還評估了肝dECM 生物墨水與商業膠原生物墨水的干細胞分化和HepG2 細胞功能，發現肝dECM 生物墨水可誘導干細胞分化并增強HepG2細胞功能；因此，其所提出的肝臟dECM 生物墨水是一種更好的選擇[25]。Zhang B 等人提出了一種通過3D 打印方法構建新型瓊脂糖3D 培養凹面微孔陣列的方法，以聚二甲基硅氧烷（PDMS）膜為橋，制備出瓊脂糖膜，并用于肝細胞球體的形成，得到的共形成肝細胞球體保持了高活性和穩定的肝特異性功能，這種工程瓊脂糖凹面微孔陣列是形成生物肝支持元件的潛在有用工具；它不僅可以應用于人體器官損傷的治療，還將用于疾病模型和藥物篩選模型的開發[26]。除了上述有支架的生物打印方式外，還有無支架的生物打印，細胞可以在不使用任何外源性結構的情況下增殖，在這種模式下，細胞通過鈣粘蛋白介導的粘附進行自組裝，從而形成3D結構[27,28]。生物墨水及打印方式等的研發是當下的研究熱點，是3D 生物打印建立高通量藥篩平臺的基礎，未來研究人員將會研制出更多更好的生物墨水材料和打印方式應用于各學科的研究工作。

2 各學科3D打印藥篩模型平臺建立的探索和應用

2.1 血管領域

血管的3D 生物打印是體外重建有功能的人造組織或器官的重要的一環。作為概念驗證，早在2012年，XU C 等人通過3D 噴墨生物打印成功地打印出具有懸垂結構的成纖維細胞基管，采用此法可以在無支架的條件下制作管狀懸挑結構，通過優化印刷條件，即使在72 h 的溫育期之后，發現成纖維細胞存活率達82%以上（控制效果好的話可達93%），由此衍生出來的制作理念方法有助于進一步研究打印幾何形狀更加復雜的組織工程血管，其前景巨大[29]。開發用于藥物篩選的仿生3D 組織結構，工程血管應被整合到所打印結構中以模仿藥物給藥過程，可灌注的血管化3D組織結構的仍然是一個熱點研究領域，HASAN A 等人介紹了一種利用光交聯明膠水凝膠在微流控平臺上制備三層仿生血管樣結構的新方法，血管的直徑、血管壁的總厚度和壁的每個單獨層的厚度是獨立控制的，這種制造工藝簡單而快速，允許在幾分鐘內3D 打印制造血管結構，并且在3-5 d 內在血管內形成血管內皮細胞層，所制備的血管構建體可潛在地用于許多應用，包括藥物篩選、心血管疾病或癌癥轉移的體外模型的開發以及血管生物學和機械生物學的研究[30]。不僅對血管的管狀結構進行生物打印重建，HORVáTH L等人還利用3D 生物打印技術對由內皮細胞、基膜和上皮細胞層組成的人空氣-血液組織屏障的類似物進行生物制造，該技術能夠自動重復地產生更薄和更均勻的細胞層，這是所需的最佳空氣-血液組織屏障，用于安全評估和藥物功效測試的高通量篩選，甚者這一生物打印平臺將為設計制造先進的3D 肺模型提供了一個極好的工具[31]。

2.2 腫瘤領域

在過去，候選藥物是使用2D 培養的腫瘤細胞和動物模型來評估的，盡管臨床應用前的測試取得成功，但是進入臨床試驗的大多數藥物還是以失敗而告終，高失敗率主要是由于當前模型的反應與人的反應并不匹配，而通過3D 打印建立高通量藥篩平臺的是未來抗癌藥物研發的重要發展方向。PARK T 等人通過噴墨打印在成纖維細胞層納米纖維膜上連續沉積膠原懸浮的Hela 細胞，制造了多孔形式的腫瘤微組織陣列，基質金屬蛋白酶2 和基質金屬蛋白酶9 在腫瘤微陣列中的表達均高于無纖維母細胞微組織，用抗癌藥物處理制備的微組織，癌癥微組織對阿霉素的發生高耐藥，而無纖維母細胞微組織卻沒有發生耐藥，提示3D腫瘤微組織陣列可用于早期藥物篩選和3D腫瘤模型研究[32]。HAM S 等人以聚合物雙水相體系為基礎，將密度較大的水相與所需密度的癌細胞混合，使用3D 打印機，將一滴該細胞懸浮液分配到含有第二浸漬水相的384 微孔板的每個孔中，癌細胞保留在井底的水滴中，并在孵化過程中形成球體，打印機的使用確保了單個液滴的精確分配，從而在每個孔中形成單個尺寸均勻的球體；用標準的化療化合物阿霉素處理乳腺癌細胞球狀體的實驗研究證明了這種方法在高通量藥物篩選中的潛力；與現有方法相比，這種球狀體培養微技術呈現出絕對的優勢，例如藥物和活性試劑的添加顯得非常容易，能夠在不將球狀體轉移到新平板上的情況下分析球狀體，以及不需要專門的平板或裝置來形成球狀體[33]。多形性膠質母細胞瘤（GBM）是人類原發性腦癌中最常見、最惡性的腫瘤，藥物治療仍然是最有效的治療方法之一，FAN Y 等人開發了一種由可光聚合的聚乙二醇二丙烯酸酯組成的水凝膠，通過快速光刻生產，在其中培養膠質母細胞瘤細胞（U87），最后在芯片上形成3D 腦癌組織；并使用該GBM 芯片進行匹伐他汀和伊立替康的聯合治療，結果表明，該芯片可有效形成GBM 腫瘤球體，具備多次同時給藥和高通量藥物測試的能力，有望成為一個強大平臺[34]。這些方法不僅應用在抗癌藥物的研發領域，還有望推廣用于其他臨床研究，加快新藥的研發。

2.3 肝臟領域

目前在肝臟生理、病理模型建立的研究領域里，通過3D 打印建立模型平臺的案例越來越多，這也為其他學科模型平臺的建立提供了有益參考。肝臟作為人體的重要器官，在人體中起著重要作用；臨床治療中由于藥物導致肝損傷的高發，因此對于藥物研發中的肝毒性檢測尤為重要，在2016 年KNOWLTON S等人報道建立了一種可用于肝毒性檢測的肝組織模型，該模型是通過3D 打印微流控裝置將肝球體封裝在水凝膠支架中并用于藥物肝臟毒性的檢測[35]。TOURLOMOUSIS F 等人首次提出將水凝膠封裝的肝細胞3D 打印到微通道的圖案化的陣列中，使其精確地嵌入到三維動態微器官裝置，灌注藥物通過肝細胞進行生物轉化，經過計算等驗證機械傳導數據、確定流出藥物和其代謝的分布[36]。雖然上述實驗只是3D打印肝模型有效性的研究和嘗試，但是這已經大大簡化了在芯片上器官模型的制造過程。由于肝衰竭和藥物性肝損傷后供肝不足，許多研究集中在開發供肝替代物和供肝體外模型，用于移植和藥物篩選。盡管已經進行了一些研究，但是這些模型還不能完全模擬肝臟的復雜性，從肝臟分離出的原代肝細胞與體內天然肝細胞非常相似，但它們在2D 培養中壽命有限，盡管可以使用夾層培養物和間充質干細胞（MSCs）延長其壽命，但是它不能完全再現體內結構；此外，長時間的2D 培養導致細胞缺氧死亡；而3D 生物打印技術已經成為克服這一限制的創新技術之一。KIM Y等人嘗試先從6-8 周齡小鼠肝臟中分離小鼠原代肝細胞，利用3D生物打印系統制作細胞-海藻酸鹽結構，結果3D打印的肝細胞存活達14 d，這個結果使得3D生物印刷技術可用于原代肝細胞的長期培養以用于藥物篩選，并將成為生產人造肝臟的潛在方法；之后他們更進一步嘗試使用人原代肝細胞和間充質干細胞（MSCs）的藻酸鹽水凝膠的3D 打印技術，分離的肝細胞存活率在90%以上，細胞存活7 d，在MSCs作用下，3D肝臟結構沒有形態學變化，這些結果表明，3D 生物打印技術和MSCs 分泌的旁分泌分子都支持肝細胞的長期培養，而不會造成細胞形態學變化，因此，這種技術允許細胞在形成多細胞聚集體的同時廣泛擴增，可以應用于藥物篩選，并且成為開發人造肝臟的有效方法[37,38]。另外有報道稱也可以通過水凝膠的不同形態和空間結構將人臍靜脈內皮細胞和脂肪源間充質干細胞通過3D 打印技術嵌入其中，研究者發現其具備更加完善的形態學組織、更高的肝特異性基因表達水平、增加的代謝產物分泌和增強的細胞色素P450誘導，從而使得3D 仿生肝臟模型得以開發出來，該模型同樣再現了天然肝臟模塊結構，可用于早期藥物篩選和疾病建模[39]。此外，在肝臟疾病模型的建立的研究中，ORTEGA-PRIETO A 等人撰文描述了一個3D 微流體原代人肝細胞系統允許乙型肝炎病毒（HBV）感染，并可以保持至少40 d。該系統能夠對HBV 生命周期的所有步驟進行概括，從而為HBV 研究提供了一個有價值的臨床前平臺[40]。

2.4 腎臟領域

生物打印的肝臟模型和腎臟模型對于制藥行業都具有極大的商業價值。亞毫米級流體系統“芯片腎”平臺的發展，不僅能夠體外再現腎臟功能，還將會對生物醫學領域產生影響深遠，包括藥物篩選、細胞和組織工程、毒性測試和疾病建模，SOCHOL R 等人論述了3D 生物打印“芯片腎”平臺和最先進的亞毫米級3D打印方法發展的最新進展，重點是生物物理和建造能力，并討論了基于3D 打印的方法擴展“芯片腎”系統功效的潛力[41]。HOMAN K 等人報告了一種用于創建體外人腎近曲小管的3D 生物打印方法，將其完全嵌入在細胞外基質中，并安置在可灌注的組織芯片中，可維持超過兩個月，這種芯片上的3D 近曲小管相對于2D 控件上生長的相同細胞，它的上皮形態和功能特性均顯著增強，當加入腎毒素環孢素A 達到一定劑量時，上皮屏障則被破壞。3D生物打印方法具備按需編程制造先進的人體腎組織模型的潛力[42]。目前在腎臟領域3D 生物打印還有待科研人員繼續探索并深入研究。

2.5 心臟領域

由于天然心肌的層次結構，心臟組織和器官模型的構建仍然是一個巨大的挑戰。整合血管的需求也帶來了更大的復雜性，限制了現有的可用于合成心血管器官的方法，通過探索，ZHANG Y 提出了一種新的基于3D 生物打印的混合策略，以制造內皮化心肌，通過使用自制特定的復合生物墨水，內皮細胞在微纖維水凝膠支架內直接活剝，逐漸向微纖維邊緣轉移，形成一層融合的內皮，之后在三維內皮細胞床上植入心肌細胞，生成能夠自發和同步收縮的排列整齊的心肌；他們進一步將這些有機化合物嵌入到一個特別設計的微流體灌注生物反應器中，以完成內皮化-心肌的心血管評估平臺，通過該技術可以構建內皮化的人心肌；3D生物打印內皮化有機化合物技術可能在再生醫學、藥物篩選和疾病建模中得到廣泛應用[43]。為了更好地對藥物反應進行全面評估，建立多個器官模型如心-肝-腎模型，來創建出更接近人體實際的具有預測性的微型化人體的平臺，該平臺甚至有可能成為代替臨床前動物實驗的最佳平臺。

2.6 骨科領域

由于全球人口的老齡化，骨病發病率急劇上升。骨缺損、骨折和骨壞死導致患者生活質量下降。自體骨、異體骨、異種骨及生物型假體已經被用于克服不同類型的骨缺損及假體置換手術，盡管被廣泛使用，但是假體耐久度相對較短，免疫排斥或植入失敗也很常見，需要開發新的骨替代物。Correia T 等人使用計算機輔助設計模型或醫學數據，通過3D 打印快速原型技術來制造3D 磷酸三鈣/海藻酸鈉支架，直接加入銀納米顆粒制備的復合支架具有良好的力學性能、生物相容性和殺菌活性，是目前最適合用于骨組織再生的復合支架[44]。在臨床上，污染或感染導致的骨缺損的治療非常棘手，而具有骨應力傳導和抗菌性能的骨替代物代表了更先進的治療策略，YANG Y 等人研究將季銨鹽殼聚糖（羥丙基三甲基氯化銨殼聚糖，HACC）植入到由聚乳酸-聚乙交酯和羥基磷灰石（HA）組成的3D 打印支架上，發現所合成的復合支架在體外和體內條件下均能降低細菌粘附和生物膜形成，支架上固定HACC可以有效地破壞微生物膜，使用的人骨髓間充質干細胞，更有利于細胞附著、增殖、擴散和成骨分化，并通過動物實驗進行生物相容性實驗，發現HA 結合支架具有良好的新生血管形成和組織整合能力，在治療骨感染的臨床應用上具有良好前景，顯示出顯著增強的抗菌活性，特別是對耐抗生素菌株的抗菌活性，以及良好的成骨活性和生物相容性，為臨床治療感染性骨缺損提供了一種有效的多孔復合支架[45]。目前骨科領域的3D 生物打印技術還多停留在骨替代物、假體的制造上，而對于骨科領域血管化仿生關節及常見慢性筋骨病、風濕及類風濕性關節炎等疾病的3D 打印藥篩平臺的設計制造目前尚無報道，這也將是今后重點研究的新領域。

3 中醫藥現代化研究

3D 生物打印技術作為新興技術在中醫藥研究領域目前尚無文獻報道，該技術在自動化、高通量、精確的空間控制以及協同培養和分層結構制造等方面具有無可比擬的優勢。可以預見的是通過3D 生物打印技術，我們將可以快速、精確、廉價的制造出各種高通量藥物篩選平臺，大大降低3D 體外系統建立的時間及經濟成本。樣品是高通量藥物篩選的物質基礎，中醫藥就是這個大規模的樣品庫，將這些各學科領域成熟的高通量藥物篩選平臺用于中藥活性成分研究與發現、中藥單體研究及大規模篩選、中藥復方作用機理的研究以及中醫疾病治療的機制研究等方面，具有廣闊的應用前景。

我們知道整體觀念是中醫學的重要思想，認為人是一個有機整體，構成人體的各組成部分之間結構上不可分割，功能上相互協調補充，病理上又相互影響；為了能夠更加準確地模擬預測人體內藥物的有效性和安全性，體外仿生系統的開發勢在必行；芯片上的器官系統是微型化的微流體三維人體組織和器官模型，其設計目的是再現其體內對應的重要生物和生理參數，這些具有仿生組成、結構和功能的體外模型極有可能取代傳統的2D 靜態細胞培養，彌合目前臨床前動物模型和人體之間的差距。如前所述，多個3D生物打印類器官模型可以通過微流體系統連接在一起，以類似體內的方式排列，并且通過一個完全集成的模塊化物理、生化和光學傳感平臺，該平臺通過一個流體路由試驗板，持續、動態和自動化的方式運行芯片上的有機單元，并具有分析多器官相互作用的能力，為目前的芯片上器官模型在藥物篩選中的性能提升鋪平了道路，通過集成大量實時傳感器實現生物物理和生化參數的自動化現場持續監測[46]。這樣的整合平臺更加接近于人體的實際狀態，更能符合中醫藥學整體觀念，通過這些整合平臺得到的實驗數據也將更加接近于人體實驗。3D 生物打印技術將會為中醫藥現代化研究提供了良好的條件，應用這些新技術、新方法，必將對中醫藥現代化研究起到積極的推動作用。

4 評價及展望

3D生物打印技術作為數字化技術的集中體現，科研人員通過利用醫學影像學圖像數據分析建立數據庫，再根據這些數據，打印制造出符合人體解剖學特點的3D 組織結構，在建立生理、病理體外模型和高通量藥物篩選模型中前景廣闊。與傳統的生物制造方法相比，3D 生物打印技術適用于細胞的共培養，細胞和生物結構的精準仿生構造，血管化仿生組織的建立，高通量制造和高度自動化的分層制造等領域。經過上述大量文獻的回顧學習，我們認識到除了目前在臨床應用領域常見的術前規劃，術中導航及骨組織工程設計制造外，3D生物打印技術還將在建立體外模型和高通量藥物篩選模型領域廣泛應用；3D打印應用于高通量藥物篩選作為當前新藥發現的手段具有選擇范圍廣、篩選成本較低、結果可靠等特點，是新藥研究的重要手段；特別是在中醫中藥領域，它可以加快中醫中藥的深入研究，利于發現中醫中藥在疾病治療過程中的作用機制，必將對中醫藥現代化研究起到積極的推動作用。通過3D 打印高通量藥物篩選的方法，可以發現更多臨床效果好，應用價值高，具有獨立知識產權的創新藥物。當然，雖然3D 生物打印的優勢凸顯，但是目前仍然缺乏有說服力的產品，還需要更多的證據來證實其構造出的模型在藥物的研究中具備和動物體內的一致性；甚至在病理模型的制備或直接打印都還有待進一步研究，同時打印設備、打印墨水以及打印方式的研發還有很長的路要走。