艾灸對胃荷瘤大鼠瘤體增長的抑制作用＊

譚 靜，陽仁達，趙 歡，彭卓雋，歐陽里知，林亞平

（湖南中醫藥大學針灸推拿學院 長沙 410208）

胃癌（gastric carcinoma）是指源于胃粘膜上皮細胞的惡性腫瘤，常以上腹部不適、疼痛、嘔吐等為主要癥狀。據國際癌癥研究機構最新統計，胃癌的發病率、死亡率分別位于惡性腫瘤的第5 位、第3 位，70%以上的新發病例集中在中國在內的發展中國家[1]。因此，胃癌的防治工作仍然是我國亟待解決的公共衛生問題。目前胃癌的治療已形成手術、放化療為主，免疫治療、熱療為輔的治療模式。近年來，隨著科學技術的發展，傳統醫學的科學內涵不斷被揭示。艾灸作為中醫學的重要組成，通過綜合熱效應激活體內經絡系統誘導各種復雜的反饋響應，實現對疾病的防治，素有“保命之法，灼艾第一”的美譽。研究表明，艾灸已積極運用于各類惡性腫瘤患者生存質量的控制管理中[2-4]。我們的前期研究表明[5]：艾灸后，胃荷瘤大鼠外周血中的自然殺傷細胞、自然殺傷性T 細胞均被激活。但艾灸對瘤體生長的抑制作用尚不明確，為此，進行了以下探索。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF 級SD 大鼠6 只，雄性，160-180 g，用于瘤組織制備；SPF 級SD 大鼠50 只，雌雄各半，200-240 g，用于分組實驗。上述動物購自中國食品藥品檢定研究院動物中心，動物生產許可證號為SCXK（京）2014-0013，動物使用許可證號為SYXK（京）2014-0003。實驗在中國醫學科學院腫瘤醫院動物SPF級動物實驗中心完成。飼養環境為12 h 晝夜節律交替，室溫25 ±5℃，相對濕度50%-70%，適應性飼養1 周。整個實驗過程中對動物的處理均遵照、符合有關的倫理學規定。

1.2 主要試劑及儀器

Walker-256 細胞（中國醫學科學院腫瘤醫院饋贈）；PCNA 抗體（美國BOSTER）；TUNEL 試劑盒（江蘇凱基）；直徑0.7 cm 艾條（長沙艾醫生物）；戊巴比妥鈉（上海化學試劑廠）；6002B型紅外線治療儀（徐州天飛有限公司）；數顯表面測溫儀（浙江波仕歐）；數顯游標卡尺（500-151-30，日本三豐）；切片機（RM2016，上海徠卡）；攤片機（KD-P，浙江科迪）；脫水機（JJ-12J，武漢俊杰）；包埋機（JB-P5，武漢俊杰）；鼓風干燥箱（DHG-9053A，上海一恒）；電熱恒溫培養箱（DHP-9162，上海一恒）；顯微鏡（DM500，德國Leica）。

1.3 模型建立方法

參考文獻[6,7]，模型建立主要包括腹水瘤制備、皮下瘤組織制備、手術移植三個過程。腹水瘤制備：將3只體重160-180 g 大鼠分別腹腔注射0.3 mL Walker-256細胞的懸液（2×107個·mL-1）。皮下實體瘤組織制備：腹腔注射7 d 后，待明顯腹水時處死動物，收集腹水中Walker-256 細胞，調整至0.5 × 107個·mL-1，皮下注射于3 只160-180 g 的大鼠右前、右后肢，每個部位0.2 mL。手術移植：皮下注射7 d 后，待注射處形成大小約1.5 × 1.5 × 1 cm3的皮下實體瘤后，處死動物，切開瘤體，取大小約0.8 × 0.8 × 0.5 cm3新鮮魚肉樣瘤組織通過手術移植于體質量200-240 g 大鼠胃大彎皮區、腺區交界處的胃壁上。7 d后剖腹探查判斷造模是否成功。模型成功標準：原種移植處形成體積0.5 cm3以上的瘤體，表面光滑，邊界清晰，無粘連及臟器侵犯，組織學證實與皮下實體瘤同源（圖1）。

圖1 皮下實體瘤（左）、胃部瘤體（右）HE染色觀察（×400倍）

1.4 實驗分組及治療

分組方法：實驗分為空白組、假手術組、模型組、艾灸組及紅外組5 組。采用隨機數字表進行隨機編號。手術模擬皮下實體瘤組織胃壁移植過程，成功后，隨機分入假手術組；通過1.3 中所述方法制備胃荷瘤動物模型，成功后，隨機分入模型組、艾灸組及紅外組。每組動物10只，雌雄各半，共計50只動物。

治療方法：造模成功的第2 d，艾灸組參考《實驗針灸學》[8]中有關大鼠穴位定位方法，仰臥位固定施灸中脘、關元、足三里（雙），隔日俯臥位固定施灸脾俞（雙）、胃俞（雙）。施灸時，將直徑為7 mm 艾條固定在自制艾灸架上于穴位垂直上方點燃。利用表面測溫儀實時監測表皮溫度，適時去除艾灰、調整施灸高度，確保表皮溫度持續在42±1℃之間。每次施灸20 min，1 日1 次，連續21 d。紅外組于造模成功后第2 d，使用波長0.4-3 μm.的短波紅外線照射，強度1 檔、輸出功率10W、光斑直徑3 cm，隔日交替照射胃脘部及背部T11 至T13 區域，治療時溫度的控制及要求、治療時間、頻次、療程同艾灸組。空白、假手術、模型組動物在同一時間段，隔日仰臥、俯臥交替捆綁束縛。

1.5 觀察指標及檢測方法

1.5.1 生存狀態積分評定

正常大鼠，活動自如，毛色光亮（5 分）；呼吸平穩，對外界刺激反應較敏銳，能站立行走，但步態較緩慢，毛色較光亮（4 分）；意識清醒，但不能四肢站立行走，可自主爬行，部分鼠毛脫落，毛質較粗糙、發黃（3分）；嗜睡，反應遲鈍、呼吸較急促、淺快，呼吸動度可，較多鼠毛脫落，毛質較粗糙、背毛聳立明顯（2分）；昏迷、靜臥不動，只有微弱的腹式呼吸運動（淺慢），或明顯節律紊亂、對外界刺激無明顯反應，或極度遲鈍、被毛聳立（1分）；死亡（0分）。

1.5.2 腫瘤生長抑制率

動物處死后，無菌環境下剖開腹腔，手術線結扎大鼠幽門部和賁門部，在兩結扎線之間剪下全胃，PBS溶液輕柔沖洗，無菌紗布吸干多余水分后將胃平攤于定型濾紙，暴露腫瘤部位，用電子游標卡尺測量胃部瘤體的最長徑（a），最小徑（b），根據公式V =（π/6）×[（a+b）/2]3，計算出腫瘤的體積。另可根據以下公式，計算腫瘤生長抑制率。

1.5.3 腫瘤組織形態學觀察

取腫瘤組織，4%低聚甲醛固定、脫水、石蠟包埋、切片。蘇木精-伊紅（HE）染色，普通光鏡下觀察腫瘤組織壞死，血管等情況。

1.5.4 免疫組化法檢測PCNA的表達

具體操作嚴格按試劑盒說明的要求進行，石蠟切片用微波修復抗原。PCNA 一抗稀釋度1∶50，DAB 顯色，蘇木精復染。PCNA 陽性細胞胞核呈棕黃色。采用北航醫學圖像分析系統于400倍鏡下采集各組腫瘤組織內3個視野的圖像，分析其陽性目標數密度。

1.5.5 TUNEL 法檢測腫瘤細胞凋亡

按照試劑盒說明進行對標本的固定、封閉、陽性制片、連接、標記、顯色、復染操作。制片后，在光學顯微鏡下觀察拍照。凋亡細胞的陽性反應物質位于細胞核內,顏色為棕黃色。采用北航醫學圖像分析系統于400 倍鏡下采集每個樣本3 個視野的圖像，分析記錄陽性細胞數密度。

1.6 統計學處理方法

所有數據使用SPSS 20.0軟件進行處理，計量資料以均數±標準差(±s)表示。所有數據資料進行正態性檢驗和方差齊性檢驗。滿足正態性時，多組間比較采用單因素方差分析，若方差齊時用LSD 法檢驗，不齊時用Dunnett T3 法檢驗。不滿足正態性時，采用秩和檢驗。以P＜0.05定義差異有統計學意義。

圖2 各組大鼠大鼠生存狀態積分比較（）

圖3 各組大鼠胃瘤體體積比較（±s）

2 結果

2.1 艾灸對荷瘤大鼠生存狀態的影響

在觀察時間內，各組均未見動物死亡。由圖2 可知：與空白組比較，模型組成模后第5 d 起生存狀態持續變差（P＜0.01）；干預15 d 后，與模型組比較，艾灸組、紅外組動物生存狀態改善，積分值增加（P＜0.01，P＜0.05），且艾灸組動物的狀態優于紅外組（P＜0.05）；干預20 d 后，艾灸組動物的生存狀態積分與空白組比較已無差異（P＞0.05）。

2.2 艾灸對荷瘤大鼠腫瘤體積及轉移的影響

干預期間內無動物死亡。干預結束處死動物、開腹探查后發現模型組、艾灸組、紅外組均有瘤體破潰消失，其中模型組1只，艾灸組6只、紅外組3只。如圖3所示，剩余動物瘤體體積組間出現差異，表現為艾灸組、紅外組瘤體體積明顯小于模型組（P＜0.01，P＜0.05），但艾灸、紅外組組間無差異（P＞0.05）。經計算，艾灸組、紅外組的腫瘤生長抑制率分別為41.89%、28.09%。另外，各組均有腫瘤細胞轉移，其中模型組4例，艾灸組1 例、紅外組6 例，轉移部位以腹水及脾臟最多（表1）。

表1 各組腫瘤細胞轉移情況

2.3 艾灸對荷瘤大鼠瘤體形態學觀察（HE）

如圖4所示，模型組瘤體內出現大量增生的血管，血管壁較厚，較少有壞死灶；艾灸組瘤體內出現大量壞死灶，血管較少；紅外組瘤體內盡管出現了一定量壞死灶，但也有大量血管增生，且血管壁較薄。

2.4 艾灸對荷瘤大鼠腫瘤細胞增殖的影響

如圖5-圖6 所示，模型組內腫瘤細胞PCNA 呈強陽性表達，艾灸組內呈弱陽性表達，紅外組內呈較強陽性表達。與模型組比較，艾灸組、紅外組陽性細胞數密度明顯減少（P＜0.01，P＜0.05），其中，艾灸組比紅外組減少更明顯（P＜0.05）。

圖4 各組腫瘤組織形態學×400倍

圖5 PCNA法檢測各組腫瘤細胞增殖×400倍

圖6 PCNA法檢測各組每平方毫米內陽性細胞數密度（±s）

圖7 Tuenl法檢測各組腫瘤細胞凋亡×400倍

圖8 TUENL法檢測各組每平方毫米內陽性細胞數密度（±s）

2.5 艾灸對荷瘤大鼠腫瘤細胞凋亡的影響

如圖7-圖8所示，Tunel法測定模型組瘤體內呈弱陽性表達，艾灸組內呈強陽性表達，紅外組內呈較強陽性表達。與模型組比較，艾灸組、紅外組陽性細胞數密度明顯增加（P＜0.01，P＜0.05），其中，艾灸組比紅外組增加更明顯（P＜0.05）。

3 討論

惡性腫瘤是威脅人類健康及社會經濟發展的重大公共健康問題。盡管其診斷已相對成熟，但其治療效果仍不理想，復發、病死率居高不下。手術、放化療作為常規抗瘤方法，其弊端日益凸顯：①非所有惡性腫瘤都符合手術指征；②放化療帶來副作用嚴重降低了患者的生存質量，削弱了治療的依從性。由于腫瘤組織內血管豐富，較正常組織更易吸收能量而升溫。研究表明[9-10]，腫瘤組織內溫度升高至40℃以上后，細胞膜的流動性及通透性增加，酶失活、代謝抑制、DNA合成受阻，腫瘤細胞將程序化死亡；另外，升溫將加劇血管內瘀阻，導致血管破裂、瘤體破潰；再者，熱刺激介導熱應激反應，促進熱休克蛋白等物質合成釋放，，促進抗體、抗原結合，阻止抗原抗體復合物脫落，激活T 淋巴細胞、巨噬細胞等，提高對腫瘤細胞的免疫殺傷[11,12]。基于此，臨床多采用紅外線、高頻電磁波等對全身或局部加熱以抗腫瘤。目前，熱療已成為臨床第五大抗腫瘤療法[13]。

艾灸作為中國傳統療法的重要組成，幾千年來為保障民生健康做出了重要貢獻。古人曾用“保命之法，灼艾第一”、“藥之不及，針之不到，必須灸之”高度贊揚了艾灸對重癥治療的重要意義。中醫認為，艾灸的溫補、溫通作用能有效針對腫瘤的“虛”、“寒”、“痰”、“瘀”、“毒”進行治療。目前，艾灸已廣泛應用于腫瘤患者各項癥狀的控制與管理當中，主要體現在減少放化療的副作用，增加攝食及免疫力，調節情緒等方面[14-16]，對艾灸直接的腫瘤抑制作用觀察較少。現代醫學認為，艾灸主要通過灸熱刺激，興奮穴位中的感受器，其介導的復雜中樞響應，誘發對神經、內分泌、免疫等多個系統對綜合調節。與單一的紅外線照射治療相比，艾灸釋放出波長600 nm 左右的紅光、2 500 nm 的中長波紅外線等綜合光線，穿透深度可達皮下1 cm 以上的深層組織，為機體的細胞代謝活動和免疫功能提供必要的能量[17-19]。由于艾灸時光線的譜形、強度、峰值在整個施治過程中都在一定范圍內不斷變化，很好地避免了溫度感受器的耐受[17]。本實驗中采用懸灸（溫和灸）進行治療，這是臨床艾灸最常使用的施灸方法。施灸時，控制表皮溫度在42℃左右，動物肛溫在灸后8 min 時上升至40℃并穩定。這種溫度既不會灼傷表皮，也能誘導熱應激反應產生。施灸過程中，荷瘤動物確無明顯的掙扎、撕叫等其他應激反應。

穴位的選擇是確保艾灸療效的關鍵因素之一。本研究中，通過詳細研究胃癌發生的病因病機，確定扶正固本、溫通經絡、散瘀消滯為主要治則，結合對現有胃癌臨床治療針灸選穴規律的數字挖掘，確定施灸穴位為脾俞、胃俞、中脘、關元、足三里。選穴局部取穴、遠端取穴結合辯證取穴，局部以胃募穴——中脘以理氣行滯，健脾和胃，提高荷瘤部位溫度；遠端以胃之下合穴——足三里健脾益氣、祛濕化痰，增強機體免疫力。選穴抓住“以虛為本”的主要病機，施灸關元以溫腎陽、壯真火，補元氣之根；施灸脾俞、胃俞補臟腑之氣，調和陰陽之氣機升降，促進納運。前后穴位交替施灸保證了穴位對灸熱刺激的敏感。實驗過程中，我們發現造模后，荷瘤動物食量、體質量、活動量顯著下降，大便稀，體現出中醫“陽虛”、“氣虛”之證。施灸后，瘤鼠上述異常得以改善。前期研究我們發現，艾灸能激活瘤鼠體內自然殺傷細胞、T 淋巴細胞，誘導大量熱應激相關蛋白的表達，但對腫瘤的抑制作用沒有詳細觀察。本研究結果證實艾灸能一定程度減少腫瘤細胞的增殖，促進其凋亡，瘤組織壞死灶增加、血管生成減少，瘤體增長被抑制。這些提示艾灸或具有直接抗癌作用，但是否與前期研究有關，具體機制如何均具有待進一步研究。