二甲雙胍對(duì)胃癌細(xì)胞糖代謝及其相關(guān)蛋白HIF-1α、PKM2表達(dá)的影響

姚萍，陳玲

(1徐州醫(yī)科大學(xué)附屬市立醫(yī)院，江蘇徐州 221004;2中國(guó)人民解放軍陸軍第七十一集團(tuán)軍醫(yī)院)

胃癌是一種常見(jiàn)的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，據(jù)報(bào)道，胃癌患者的病死率僅次于肺癌[1]。腫瘤細(xì)胞進(jìn)行能量代謝所必需的底物是葡萄糖，且其對(duì)葡萄糖的攝取能力是普通細(xì)胞的10倍，糖酵解能力是普通細(xì)胞的20～30倍[2]。關(guān)于胃癌等癌細(xì)胞糖代謝相關(guān)內(nèi)容是腫瘤代謝領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)，糖代謝異常作為一種病理生理狀態(tài)在胃癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中貫穿始終[3,4]。二甲雙胍是臨床常用的口服降糖藥，近年研究發(fā)現(xiàn)，其降糖的同時(shí)還具有抑制腫瘤的作用，可降低糖尿病患者腫瘤發(fā)病率，因而得到廣泛關(guān)注[5]。有研究表明，二甲雙胍可通過(guò)影響腫瘤細(xì)胞葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)和糖酵解過(guò)程，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖[6]。M2型丙酮酸激酶(PKM2)是細(xì)胞糖酵解通路中的關(guān)鍵限速酶。在細(xì)胞缺氧時(shí)，缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)被激活，進(jìn)而激活下游的糖酵解酶基因轉(zhuǎn)錄。研究表明，HIF-1α與PKM2存在密切聯(lián)系，可相互促進(jìn)表達(dá)[7]。2018年5月，我們以不同濃度二甲雙胍干預(yù)胃癌MGC-803細(xì)胞，檢測(cè)糖代謝相關(guān)蛋白HIF-1α、PKM2表達(dá)，探討二甲雙胍對(duì)胃癌糖代謝的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 RPMI1640培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司)；FBS(美國(guó)Hyclone公司)；胰蛋白酶1∶250(美國(guó)Gibco公司)；青鏈霉素混合液(北京索萊寶科技有限公司)；乳酸檢測(cè)試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司)；葡萄糖檢測(cè)分析試劑盒(上海金畔生物科技有限公司)；通用型蛋白酶抑制劑(上海威奧生物科技有限公司)；蛋白抽提試劑(德國(guó)MERCK)；ECL發(fā)光液(德國(guó)Merck Millipore公司)；RT-PCR試劑盒(美國(guó) Thermo Scientific 公司)；SYBR Green熒光實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒(羅氏生物科技公司)；TRIzol總RNA提取試劑(日本TAKA-RA公司)；引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；HIF-1α兔抗人單克隆抗體(美國(guó)Abcom公司)；PKM2兔抗人單克隆抗體(美國(guó)Cell Signaling公司)。兔抗人GAPDH單克隆抗體(美國(guó) Bioworld 公司)；通用型二抗試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。倒置熒光顯微鏡(日本Olympus公司)；恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)賽默飛公司)；450型全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(美國(guó)百特公司)；恒壓電源、電轉(zhuǎn)槽、電泳槽、Bio-Rad成像系統(tǒng)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)Bio-Rad公司)。二甲雙胍購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；MGC-803細(xì)胞株購(gòu)自上海中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞所。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 將MGC-803細(xì)胞均勻接種于含有10%FBS、100 U/mL青、鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中，于5%CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。鏡下觀察，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，用0.25%胰蛋白酶消化液消化2 min，加含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基終止消化。轉(zhuǎn)移至離心管中，1 000 r/min，離心2 min，棄上清，再加入新的10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基將細(xì)胞吹打均勻，分瓶種于新的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，一般2～3 d進(jìn)行1次傳代。傳代后的細(xì)胞根據(jù)培養(yǎng)體系不同分為陰性對(duì)照組和二甲雙胍低、中、高劑量組，于溫箱培養(yǎng)24 h，吸出培養(yǎng)基，每組細(xì)胞均換成不含F(xiàn)BS的 RPMI1640培養(yǎng)液同步培養(yǎng)24 h。

1.3 葡萄糖攝取量檢測(cè) 細(xì)胞貼壁并且同步培養(yǎng)后，二甲雙胍低、中、高劑量組分別加入含1、5、10 mmol /L二甲雙胍的培養(yǎng)基，陰性對(duì)照組培養(yǎng)基不變，細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，收集培養(yǎng)基上清液，并設(shè)置空白對(duì)照組(即新的空白培養(yǎng)基)，按照葡萄糖檢測(cè)分析試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出各組培養(yǎng)基上清液中葡萄糖含量，各組細(xì)胞的葡萄糖攝取量=空白對(duì)照組葡萄糖含量-各組培養(yǎng)基中葡萄糖含量。

1.4 乳酸生成量檢測(cè) 同1.3中操作步驟，MGC-803細(xì)胞經(jīng)二甲雙胍處理24 h后，收集培養(yǎng)基上清，按照乳酸檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。應(yīng)用450型自動(dòng)酶標(biāo)儀在530 nm波長(zhǎng)處測(cè)定并記錄樣品吸光度。乳酸生成量計(jì)算公式：乳酸生成量(mmol/L)=3×(樣品-空白對(duì)照)/(標(biāo)準(zhǔn)品-空白對(duì)照)。

1.5 HIF-1α、PKM2蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用Western blotting法。各組細(xì)胞經(jīng)二甲雙胍(0、1、5、10 mmol/L)處理24 h后，棄去培養(yǎng)基，并用預(yù)冷的PBS沖洗3次，用胰蛋白酶將細(xì)胞消化下來(lái)并用RPMI1640培養(yǎng)基終止，轉(zhuǎn)移至離心管中，離心棄上清，再用預(yù)冷的PBS沖洗3次，離心棄上清，各組加入蛋白裂解液于冰上裂解30 min，每隔5 min搖晃1次，離心留取上清，BCA法測(cè)定蛋白濃度，煮水浴8 min進(jìn)行蛋白變性處理。蛋白上樣量為40 μg，70 V電泳至濃縮膠與分離膠邊界時(shí)(約30 min)，調(diào)為110 V繼續(xù)電泳1 h，60 V恒壓轉(zhuǎn)膜2 h，5% BSA室溫封閉2 h，GAPDH一抗(1∶1 000)，HIF-1α一抗(1∶500)，PKM一抗(1∶1 000)，于4 ℃冰箱中孵育過(guò)夜，TBST洗，二抗(1∶2 000)室溫?fù)u床孵育1 h，化學(xué)發(fā)光、顯影，通過(guò)Image J軟件統(tǒng)計(jì)灰度值，計(jì)算HIF-1α、PKM2蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.6 HIF-1α、PKM2 mRNA表達(dá)檢測(cè) 采用Real-time PCR法。各組細(xì)胞經(jīng)二甲雙胍(0、1、5、10 mmol/L)處理24 h后，棄去培養(yǎng)基，并用預(yù)冷的PBS沖洗3次，使用TRIzol試劑提取各組細(xì)胞的總RNA，并測(cè)量各組RNA濃度，取1 μg RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，根據(jù)Real-time PCR反應(yīng)體系取5 μL cDNA作為模板，擴(kuò)增條件：50 ℃ 2 min、95 ℃ 2 min、95 ℃ 15 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min，循環(huán)擴(kuò)增38次，每份樣本的基因拷貝數(shù)用Ct 值表示，采用2-ΔΔCt法分析基因相對(duì)表達(dá)量。HIF-1α正向引物：5′-TGCAACATGGAAGGTATTGC-3′，反向引物：5′-TTCAAATCAGCACCAAGC-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度118 bp。PKM2正向引物：5′-AGAACATCCTGTGGCTGGAC-3′，反向引物：5′-ACCTTTCTGCTTCACCTGGA-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度107 bp。GAPDH正向引物：5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′，反向引物：5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度98 bp。

2 結(jié)果

2.1 二甲雙胍對(duì)MGC-803細(xì)胞葡萄糖攝取量的影響 陰性對(duì)照組和二甲雙胍低、中、高劑量組葡萄糖攝取量分別為(1 962±60.23)、(1 633±72.65)、(1 415±83.25)、(1 230±65.94)μmol/L，與陰性對(duì)照組比較，二甲雙胍低、中、高劑量組葡萄糖攝取量均不同程度下降(P均<0.05)；與低劑量組比較，中、高劑量組葡萄糖攝取量下降(P均<0.05)。

2.2 二甲雙胍對(duì)MGC-803細(xì)胞乳酸生成量的影響 陰性對(duì)照組和二甲雙胍低、中、高劑量組乳酸生成量分別為(5.00±0.321)、(4.22±0.210)、(3.30±0.154)、(2.73±0.170)mmol/L，與陰性對(duì)照組比較，二甲雙胍低、中、高劑量組乳酸生成量均有所下降(P均<0.05)；與低劑量組比較，中、高劑量組乳酸生成量均下降(P均<0.05)。

2.3 二甲雙胍對(duì)MGC-803細(xì)胞HIF-1α、PKM2蛋白表達(dá)的影響 陰性對(duì)照組和二甲雙胍低、中、高劑量組HIF-1α蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.721±0.031、0.564±0.052、0.509±0.061、0.420±0.024，與陰性對(duì)照組比較，二甲雙胍低、中、高劑量組HIF-1α蛋白表達(dá)降低(P均<0.01)，與二甲雙胍低劑量組比較，二甲雙胍高劑量組HIF-1α蛋白表達(dá)降低(P<0.05)。陰性對(duì)照組和二甲雙胍低、中、高劑量組PKM2蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.684±0.071、0.441±0.063、0.391±0.050、0.307±0.042，與陰性對(duì)照組比較，二甲雙胍低、中、高劑量組PKM2蛋白表達(dá)降低(P均<0.01)，與二甲雙胍低劑量組比較，二甲雙胍高劑量組PKM2蛋白表達(dá)降低(P<0.05)。

2.4 二甲雙胍對(duì)MGC-803細(xì)胞HIF-1α、PKM2 mRNA表達(dá)的影響 陰性對(duì)照組和二甲雙胍低、中、高劑量組HIF-1α mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為1.000±0.000、0.787±0.036、0.648±0.021、0.604±0.034，PKM2 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為1.000±0.000、0.716±0.023、0.621±0.040、0.498±0.032，與陰性對(duì)照組比較，二甲雙胍低、中、高劑量組HIF-1α、PKM2 mRNA表達(dá)降低(P均<0.01)；與二甲雙胍低劑量組比較，二甲雙胍高劑量組HIF-1α、PKM2 mRNA表達(dá)降低(P均<0.05)。

3 討論

胃癌細(xì)胞進(jìn)行活躍的能量代謝，并將葡萄糖作為主要的ATP來(lái)源[8]。臨床多數(shù)胃癌患者處于圍手術(shù)期時(shí)，受到外界因素的刺激而長(zhǎng)期處于一種應(yīng)激狀態(tài)，癌細(xì)胞便會(huì)啟動(dòng)DNA損傷修復(fù)等一系列自我防御機(jī)制來(lái)適應(yīng)，該過(guò)程需消耗大量的ATP進(jìn)行能量代謝。腫瘤細(xì)胞能量代謝的主要方式是高水平的糖酵解，由于腫瘤具有快速增殖的特點(diǎn)，使其常處于缺氧環(huán)境中，而糖酵解活動(dòng)則可使腫瘤細(xì)胞即使在缺氧條件下，仍可正常生長(zhǎng)。糖代謝異常是腫瘤細(xì)胞的一個(gè)重要特征，亦是腫瘤快速增殖、生長(zhǎng)的關(guān)鍵特征，正如德國(guó)生物化學(xué)家瓦博格提出的瓦博格效應(yīng)一樣[9]，腫瘤細(xì)胞通過(guò)糖酵解快速獲得能量。

丙酮酸激酶(PKM)有兩種亞型，即PKM1、PKM2，其中PKM2在腫瘤細(xì)胞糖酵解及細(xì)胞增殖過(guò)程中發(fā)揮重要作用。PKM2以一種低活性的二聚體形式存在于腫瘤細(xì)胞中，是糖酵解的最后一個(gè)限速酶，在腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)[10]，而腫瘤中PKM2高表達(dá)與其TNM分期及預(yù)后密切相關(guān)[11]。HIFs屬于一種核轉(zhuǎn)錄因子，包括HIF-1α和HIF-2α，是參與缺氧調(diào)節(jié)最重要的兩種缺氧誘導(dǎo)因子，當(dāng)腫瘤細(xì)胞缺氧時(shí)，轉(zhuǎn)錄并激活多種下游因子，使其耐受缺氧狀態(tài)[12]?；罨腍IF-1α在糖代謝途徑發(fā)揮主導(dǎo)功能，并調(diào)控多種靶基因的轉(zhuǎn)錄，而關(guān)于HIF-2α在這方面的作用研究甚少，PKM2充當(dāng)HIF-1α的輔助轉(zhuǎn)錄因子，在腫瘤細(xì)胞核中與HIF-1α相互作用，影響腫瘤細(xì)胞的能量代謝及增殖、凋亡產(chǎn)生[13]。

二甲雙胍可通過(guò)降低腫瘤細(xì)胞耗氧量，抑制HIF-1α的聚集[14]，并抑制HIF-1α的合成，從而抑制腫瘤血管生成和腫瘤生長(zhǎng)。在對(duì)咽癌、甲狀腺癌等腫瘤細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍可有效抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、促進(jìn)其凋亡[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，用不同濃度的二甲雙胍處理MGC-803細(xì)胞后，其葡萄糖攝取量及乳酸生成量均下降，說(shuō)明二甲雙胍減弱了其糖代謝活動(dòng)，且二甲雙胍濃度越高，作用越顯著，二甲雙胍可明顯抑制MGC-803細(xì)胞中HIF-1α、PKM2表達(dá)，有效抑制胃癌細(xì)胞的能量代謝，其機(jī)制可能與抑制HIF-1α、PKM2基因及蛋白表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，二甲雙胍可抑制胃癌細(xì)胞糖代謝，影響癌細(xì)胞生長(zhǎng)的能量供應(yīng)，抑制糖代謝相關(guān)蛋白HIF-1α、PKM2表達(dá)。