代謝組學分析技術在口腔軟組織疾病診斷及治療中的應用進展

孫向輝，張磊，韓濤

(天津市第三中心醫院·天津市人工細胞重點實驗室·衛生部人工細胞工程技術研究中心，天津300170)

代謝組學是眾多組合學科研究中的一種，是通過考察生物體系受刺激后(如將某個特定的基因變異或環境變化后)代謝產物的變化或其隨時間的變化來研究生物體系的一門科學[1]，其研究涉及生命科學、儀器分析及化學計量學方面的專業知識，關注的對象是生物體內分子量低于1 000道爾頓的小分子化合物。臨床中代謝組學是以組群特征分析為基礎，以如超高效液相色譜、超高分辨生物質譜及核磁共振(NMR)等高通量分離、檢測和數據處理為手段，基于生物大數據，通過大量的計算機復雜運算，從相互比對的海量數據中提取出豐富的相關有用信息，其優點在于對于生物標本檢測更容易、不需要特征化的數據庫、種類少、代謝產物具有通用性[2]，文獻中存在豐富的關于代謝途徑和代謝物生化性質的信息[3]。近年，隨著代謝組學的不斷發展，其研究優勢和前景被越來越多的學者所認知，目前代謝組學分析技術在各類腫瘤疾病、心肌疾病、遺傳代謝疾病及感染性疾病中的應用非常廣泛，但在口腔醫學領域方面的應用研究仍少見。本研究中，我們就代謝組學分析技術在口腔軟組織疾病即牙周病、黏膜病及口腔癌病變等診斷及治療中的最新應用進展作以下綜述，引起臨床及科研工作者的關注，應用代謝組學分析技術解決口腔疾病診療領域亟待解決的問題，豐富口腔臨床診療手段。

1 代謝組學分析技術在牙周病發病機制、診斷、療效評估中的應用

牙周病是人類口腔的常見病、多發病，是牙齒脫落的主要原因。目前已公認牙周病是多因素疾病，細菌及其產物是引發牙周病必不可少的始動因子，而全身因素在牙周病的發展中屬于促進因子，內分泌失調、飲食與營養狀況、血液病及服用藥物等因素可以降低或改變牙周組織對外來刺激的抵抗力，使之易于患病，并可促進牙齦炎和牙周炎的發展。細菌及產物局部刺激因素的影響與全身因素的調控相互聯系、互為協同，或相互影響、互為拮抗。要闡明牙周病的發病機制，需了解各種因素之間的相互作用，代謝組學分析方法更接近生物學表型，反映的是已經發生的生物學事件，亦是各種因素共同作用的綜合結果，是生物體系生理和生化功能狀態的直接體現，更有助于找到牙周病發生發展多因素之間相互作用關系及產生機制。

1.1 代謝組學分析技術在牙周病發病機制探討中的應用 牙周炎是最常見的口腔疾病，由宿主與口腔細菌的多因素相互作用引起。宿主和微生物的細胞代謝改變釋放出許多中間產物。人們越來越感興趣的是從口腔液體如唾液中鑒別代謝物，以加深對牙周炎復雜發病機制的理解。Chen等[4]收集健康對照組20例和廣泛性侵襲性牙周炎(GAgP)患者20例，分別收集血清和齦溝液樣品，用氣相色譜與生物質譜聯用方法測定了樣品中生物標志物的相對含量，牙齦溝液樣品中定性地檢測到349種代謝物，并在血清樣品中檢測到200種代謝物。與健康對照組相比，GAgP患者血清尿素和異丙肌醇水平顯著升高，谷胱甘肽、2，5-二羥基苯甲醛、己二酸和2-脫氧鳥苷水平降低。在牙齦溝液樣本中，GAgP患者的去甲腎上腺素、尿苷、α-生育酚、脫氫抗壞血酸、黃嘌呤、半乳糖、葡萄糖-1-磷酸和核糖-5-磷酸水平升高，而胸苷、谷胱甘肽和核糖-5-磷酸水平降低。GAgP和健康對照組患者血清和齦溝液代謝組學有顯著性差異。這些代謝特征在GAgP診斷和幫助理解其潛在機制方面具有巨大潛力。

1.2 代謝組學分析技術在牙周病診斷中的應用 代謝組學研究篩選的特征代謝物可能是早期發現和篩選牙周炎的指標，甚至可能是未來監測其預后的指標。由于當代牙周篩查方法的不足，迫切需要新的牙周篩查方法。Liebsch等[5]通過液相色譜與質譜聯用的測試方法研究9例牙周炎唾液代謝輪廓，檢測獲得284項唾液代謝產物與口腔參數(臨床附著水平、牙周探測深度、齦上菌斑、齦上結石、缺牙數量和可摘義齒)，結果顯示唾液代謝組分的變化與年齡和口腔健康狀況有關，牙周炎與細菌代謝產物苯乙酸顯著相關，提示苯乙酸是一種很有前景的生物標志物研究物質。

Romano等[6]采集32例對照組和19例廣義慢性牙周炎(GCP)患者在常規分期非手術牙周治療前和3個月后獲得未刺激的唾液,使用NMR檢測方法進行代謝輪廓分析，然后采用單變量和多變量配對方法評估治療后代謝指標的變化,結果顯示GCP患者治療后乳酸、丙酮酸、纈氨酸、脯氨酸、酪氨酸和甲酸鹽水平與健康對照組相比仍存在差異。基于這些數據，NMR波譜分析顯示，盡管非手術治療后整體代謝指紋圖譜發生了顯著變化，但與健康個體相比，GCP患者仍保持著獨特的代謝特征。Romano等[7]在更早期研究中從臨床診斷為33例廣泛慢性牙周炎GCP及28例GAgP患者唾液樣本和39例健康對照(Hi)唾液樣本中獲取NMR代謝譜，采用主成分分析和NMR譜的典型相關分析相結合的方法，實現了各組間的聚類分析。結果顯示Hi與GCP，Hi與GAgP代謝輪廓差異是顯著的，預測準確率均達到81%，而GAgP和GCP唾液樣本代謝輪廓差異并不顯著，只有60%的預測準確度；與Hi組相比，GCP和GAgP患者丙酮酸、N-乙酰基和乳酸水平顯著降低，脯氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸水平顯著升高，以上基于唾液水平的多指標快速聯合診斷為GAgP臨床診斷提供了更多診療指標。

1.3 代謝組學分析技術在牙周病療效評估中的應用

代謝輪廓動態跟蹤分析可以為治療方法使用或藥物干預效果提供可靠的評判依據。Li等[8]利用1-氫核磁共振(1H-NMR)檢測方法，觀察補腎固齒丸對牙周炎大鼠血清代謝輪廓的影響，采用鋼絲結扎、高葡萄糖飲食和牙齦卟啉單胞菌接種等方法建立大鼠實驗性牙周炎模型，建立模型后，將31只6周齡Sprague-Dawley雌性大鼠分為5組進行補腎固齒丸給藥治療：高劑量給藥組、中劑量給藥組、低劑量給藥組、牙周炎組和健康對照組，實驗結束后處死大鼠，收集血清標本，用主成分分析(PCA)和偏最小二乘判別分析(PLS-DA)結合1H-NMR對血清中的代謝輪廓進行分析，研究結果顯示5組的代謝譜顯示各組個體數據集的聚類，第一主成分和第二主成分能顯著區分中、高劑量組和其他組，1H-NMR譜圖中顯示在δ1.22 ppm、1.86 ppm、2.26 ppm、2.34 ppm和2.42 ppm的化學位移區，5組間差異最明顯，相應的特征代謝產物為高密度脂蛋白、丙酮酸/草酰乙酸、精氨酸和谷氨酰胺等，補腎固齒丸對牙周炎大鼠血清代謝物的影響呈劑量依賴關系，高密度脂蛋白、丙酮酸/草酰乙酸、精氨酸和谷氨酰胺是補腎固齒丸對于牙周炎疾病能夠產生有效治療作用的血清檢測指標，代謝組學分析技術為牙周炎治療靶點的篩選及藥物療效評價提供了新的研究方向。

2 代謝組學分析技術在口腔黏膜病預防、發病機制探討及鑒別診斷中的應用

口腔黏膜病即口腔某一部位黏膜的正常色澤、外形、完整性與功能等發生改變的疾病，主要包括復發性口腔潰瘍、白塞病、扁平苔癬和慢性咽炎等。其病變種類繁多，可以組合成復雜多樣的損害，有些全身性疾病也在口腔黏膜上有所表現，而有些口腔表征可作為全身疾病診斷的依據或線索。其發病因素方面，除了少數與口腔條件直接相關外，絕大多數與全身或系統因素的關系密切。隨著免疫學研究的不斷發展，發現與自身免疫有關的口腔黏膜病在臨床上已屢見不鮮，同時及時干預潛在惡性病損，即口腔黏膜白斑病[9]及口腔扁平苔蘚[10]等，可起到阻斷癌變的臨床效果。小分子產生和代謝產物是這一系列事件的最終結果，其能更準確地反映生物體系的狀態，利用代謝組學研究方法，全面系統地對口腔黏膜病機制進行研究，找尋病因及干預靶點，將具有極廣泛的科研與臨床應用前景。

2.1 代謝組學分析技術在口腔黏膜病預防中的應用 Sridharan等[11]采用液相色譜與飛行時間質譜聯用方法，比較了21例口腔白斑患者和22例口腔鱗狀細胞癌(OSCC)患者與18例明顯正常對照者的唾液代謝輪廓，結果顯示在口腔白斑和OSCC中，1-甲基組氨酸、肌醇1,3,4-三磷酸、D-甘油酯-2-磷酸、4-硝基喹啉-1-氧化物、2-氧代黃嘌呤、諾可卡因-氧化亞氮、鞘氨醇-1-磷酸和假尿苷的表達顯著上調；L-高半胱氨酸、泛醌、神經氨酸和戊酸雌二醇患病組下調，口腔白斑和OSCC患者的唾液代謝產物范圍有明顯改變。對于代謝產物個體評價在預防口腔白斑惡性轉化和改善OSCC預后方面具有潛在臨床應用價值。Yang等[12，13]均采用超高效液相色譜與四極桿飛行時間質譜聯用方法，結合模式識別數據處理方法，比較了侵蝕性口腔扁平苔蘚(OLP)患者和健康對照組的血清與尿液代謝輪廓，并用綜合分析方法對擾動性代謝進行了鑒別，結果顯示鑒定出的多種失調代謝產物可作為侵蝕性OLP的潛在生物標志物，其相關代謝途徑及病理過程可能是該疾病的潛在防治靶點。

2.2 代謝組學分析技術在口腔黏膜病發病機制探討中的應用 Li等[14]采集16例網狀OLP患者和24例對照受試者血樣，采用液相色譜與質譜聯用方法對血樣代謝物輪廓進行分析，結果顯示共鑒定31種失調代謝產物，其影響了25種代謝途徑和7種病理過程，病理網絡顯示，這些代謝產物參與了7個病理過程，即凋亡過程、DNA損傷與修復障礙、氧化應激損傷、碳水化合物代謝障礙、情緒障礙、炎癥損傷等病理過程。網狀OLP引起血清代謝物變化可能通過血液系統進一步與其他器官和系統疾病聯系在一起，如糖尿病、睡眠障礙和抑郁癥等。

2.3 代謝組學分析技術在口腔黏膜病鑒別診斷中的應用 Cruz等[15]采用氣相色譜與質譜聯用法對6例侵蝕性OLP和10例網狀OLP的甲醛固定和石蠟包埋組織樣品進行了代謝輪廓比較分析，顯示侵蝕型和網狀型兩種臨床變異具有明顯的臨床代謝輪廓特征，與網狀型OLP相比，侵蝕性OLP中環己胺、甘氨酸、甘露醇/山梨醇、棕櫚酸甲酯和海藻糖5種代謝產物顯著減少，該研究結果提示有必要進一步使用大量新鮮組織樣本進行確證。

3 代謝組學分析技術在口腔癌預防、發病機制探討及早期診斷中的應用

口腔癌是全球最常見的頭頸惡性腫瘤，其中OSCC占90%以上[16]，將近一半的患者在初診時即已發生頸部淋巴結轉移[17]。OSCC 5年生存率約50%，經早期診斷并治療的患者5年生存率可提高至85%[18]，目前診斷口腔癌主要采取活組織病理檢查，但為有創性檢查，且臨床普遍應用的腫瘤標志物特異性不佳，所以在篩查及早期診斷中應用受限。代謝組學研究是把異常的代謝物及相關代謝機制作為臨床診斷的工具，可以使我們在“先發制人的策略中”進一步探究干預的效果(包括藥物和營養)，將代謝組學帶入至口腔癌研究中，探索該類疾病發生發展過程中代謝指紋圖譜的變化規律，有助于揭示發病機制，找尋早期診斷標志物，找尋治療靶點、判斷預后與疾病轉歸。

3.1 代謝組學分析技術在口腔癌預防中的應用 Sridharan等[19]的研究利用液相色譜與四極桿飛行時間質譜聯用法對口腔白斑和OSCC患者的血清代謝輪廓特征與健康對照組進行比較，結果顯示口腔白斑和OSCC組的雌二醇-17-β-3-硫酸鹽、左旋肉堿、5-甲基硫腺苷(MTA)、8-羥腺嘌呤、2-甲基檸檬酸、腐胺和雌激素-3-硫酸鹽等表達明顯高于正常對照組，此外OSCC組中5，6-二氫尿苷、4-羥基戊巴比妥洛爾葡萄糖醛酸、8-羥基腺嘌呤和腐胺的表達明顯高于口腔白斑組，L-肉堿、賴氨酸、2-甲基檸檬酸、腐胺、8-羥腺嘌呤、17-雌二醇、5,6-二氫尿苷和MTA的上調提示它們在口腔白斑和OSCC中的診斷潛力，此外OSCC相比口腔白斑組腐胺、8-羥腺嘌呤和5,6-二氫尿苷呈顯著上調趨勢，表明以上幾種代謝物具有預測口腔白斑是否發生惡性轉化中的潛在診斷能力。

3.2 代謝組學分析技術在口腔癌發病機制探討中的應用 Hsu 等[20]采用基于生物質譜的化學同位素標記定量代謝組學方法，分析31例OSCC患者癌組織和鄰近非癌組織中代謝物水平的變化，利用火山圖和正交偏最小二乘判別分析，找尋到OSCC中99種失調代謝物，并鑒定驗證了其中的7種，利用該7種代謝物構建了一個由腐胺、甘氨酸、苯丙氨酸組成的三標記模板，利用基于接收算子特征分析的支持向量機分析器模型，將不同組織類型進行區分，同時通過代謝通路分析揭示了OSCC中多胺途徑的失調。

3.3 代謝組學分析技術在口腔癌早期診斷中的應用 Mikkonen等[21]研究探討NMR波譜在檢測頭頸部鱗狀細胞癌(HNSCC)相關唾液代謝變化方面的潛力，該研究采用1H-NMR波譜分析了從HNSCC患者(原發腫瘤位于喉部或口腔)和健康對照者身上采集的全口唾液樣本，通過Mann-WhitneyU檢驗對可靠鑒定的唾液代謝物進行定量分析，并對測定的濃度進行分組比較，利用多變量鑒別功能分析(DFA)篩選特征代謝物組合模式，能最大限度地區分各組，HNSCC患者中1,2-丙二醇和巖藻糖濃度顯著升高，而脯氨酸水平降低，在DFA模型中，當巖藻糖、甘氨酸、甲醇和脯氨酸作為組合生物標志物時，識別率最高，正確的分類率為92.1%，敏感性為87.5%，特異性為93.3%，研究結果顯示唾液對HNSCC的代謝變化敏感，且易于無創收集，提示巖藻糖類物質可作為HNSCC的診斷性生物標志物。

Enomoto等[22]收集48例OSCC患者和29例口腔疾病患者的血漿樣本，并用氣相色譜與生物質譜聯用法對OSCC患者進行了血漿代謝組學分析，篩選出壬酸、葡萄糖、半乳糖和半胱氨酸+胱氨酸等四個生物標記，根據受試者工作特性曲線(AUC)分析，其診斷OSCC的靈敏度大于90%，AUC曲線下面積大于0.9，新型代謝標志物的聯合診斷將大大提升該疾病的臨床診斷效能。

Lohavanichbutr等[23]采集101個OSCC、58個OPC和35個正常對照組的唾液樣本，利用NMR及液相色譜與生物質譜聯用法分別測試水溶液樣本，同時利用液相色譜與四級桿飛行時間質譜聯用方法測試脂溶性樣本，結果顯示OSCC和對照組甘氨酸和脯氨酸兩種代謝產物水平存在顯著差異，但在有或無淋巴結轉移的OSCC和對照組之間，代謝產物水平沒有發現任何明顯的差異，其中4種代謝產物包括甘氨酸、脯氨酸、瓜氨酸和鳥氨酸與早期OSCC相關，有必要進一步研究證實該實驗結果。

綜上所述，代謝組學研究方法以其獨特的高通量檢測手段及大數據基礎上的生物信息分析方法等的組合技術優勢，能夠針對口腔疾病領域復雜生物樣本類型進行檢測分析，對唾液及代謝輪廓的研究不僅可以靶向關注異常代謝通路，分析牙周炎、口腔黏膜病及口腔癌的發病機制；同時其獨特對生物學終末事件的關注視角，可更有效地評價藥物對于牙周炎的綜合治療效果，判斷口腔黏膜疾病不良轉歸狀態，找尋口腔癌的早期診斷指標。當今世界范圍內對于口腔疾病的代謝組學研究處于疾病人群橫斷面分析及動物模型研究階段，國內研究進展更是鮮見，且臨床應用價值尚不明確，廣泛開展縱向跟蹤研究及臨床適用性評價前景廣闊。我國廣大的臨床醫生及科研工作者立足于我國各不同地域的人群代謝特征，開展口腔疾病的代謝組學研究，找尋疾病發生發展與環境、飲食、生活習慣等相關性，探索發病機制，篩選新型早期診斷、預后判斷及病程轉歸標志物，找尋干預靶點，探究中醫藥對于口腔疾病的療效等，必將為口腔疾病的臨床診療帶來變革與新希望。