蒲公英水提液抗病毒有效部位篩選及體外抗病毒作用觀察

謝士敏，劉英男，劉子皓，周長征

(1山東中醫藥大學，濟南250300；2山東中醫藥大學藥學院)

蒲公英為菊科植物蒲公英TaraxacummongolicumHand.-Mazz.、堿地蒲公英Tarxacumborealisinense Kitam.或同屬數種植物的干燥全草；味苦、甘，性寒；有清熱解毒、消腫散結、利尿通淋等功效，在疔瘡腫毒、乳癰、瘰疬、目赤、咽痛、肺癰、腸癰、濕熱黃疸、熱淋澀痛[1]等病癥中經常運用。現代藥理學數據研究統計顯示，蒲公英具有抑菌[2，3]、抗腫瘤[4，5]、抗氧化[6]、降血糖[7]、抗炎[8]、利尿[9]、調節免疫等多項功效，此外，蒲公英煎劑或水提物能緩解延遲皰疹病毒引起的病變[10～12]。蒲公英中屬植物的化學成分復雜而多樣，截至目前，在蒲公英中分離出的有黃酮類、萜類、酚酸類、甾醇類、香豆素類、揮發油類等化學成分[13]。目前蒲公英抗病毒領域的研究還比較少，其具體抗病毒成分仍未明。2018年2月～2019年3月，本研究選取腸道病毒-71(EV-71)病毒，采用病毒示蹤法對蒲公英抗病毒有效部位進行篩選并對其體外抗病毒作用做出探討。

1 材料與方法

1.1 蒲公英、病毒株、宿主細胞、試劑及儀器 中藥蒲公英(購于吉林國安藥業有限公司)。病毒株與宿主細胞：呼吸道合胞病毒(RSV)、單純皰疹病毒(HSV)、EV-71病毒引自中國疾病預防控制中心病毒病研究所流感病毒研究室，猴胚胎腎細胞(MA104)由山東省醫學科學院基礎醫學研究所微生物室所提供。主要試劑：1640細胞培養液(美國GIBCO產品，含質量分數為10%新生牛血清及100 μL/mL青霉素和鏈霉素)；PBS磷酸鹽緩沖溶液(自制)(含 NaCl 8 g，KCl 0.2 g，KH2PO40.2 g，Na2HPO42.9 g，加三蒸水至 1 L，過濾除菌，并分別儲存，置 4 ℃ 保存備用)；EDTA-0.25%胰酶(Amresco公司)；0.1%中性紅染料(上海化學試劑三廠)。主要儀器：D101型大孔樹脂(滄州寶恩吸附材料科技有限公司)；CO2細胞恒溫培養箱(美國FOMAS公司)；CO2病毒恒溫培養箱(上海躍進醫療器械一廠)；高速臺式離心機(長沙湘智離心機儀器有限公司)；CKX-31倒置顯微鏡(Olympus公司)；熒光倒置顯微鏡(Olympus公司)；MK3酶標儀(Labsystems公司)。

1.2 蒲公英不同樣品的制備 ①蒲公英水提液的制備：采用蒸餾水回流提取法。稱取蒲公英藥材50 g，利用蒸餾水進行兩次提取，提取時間和料液比例分別是2 h、1∶10與1.5 h、1∶8；然后趁熱抽濾，合并濾液，把濾液減壓濃縮至50 mL，并將其置入EP管中，并貼標簽備注樣品A。② 樣品A醇沉樣品的制備：量取上述水提取液40 mL，其次將其緩慢加入體積分數為95%的乙醇并迅速攪拌至完全溶解，將乙醇濃度調節至50%，然后冷藏靜置24 h、抽濾、向濾餅中加入適量水超聲溶解，并濃縮至質量分數為1 g/mL，最后將其裝入EP管中，上清液和沉淀溶解液分別貼標簽備注樣品B、樣品C。③樣品B、C醇化液的制備：參照王鵬飛等[14]的實驗方法，進行D101大孔樹脂的預處理。處理完成后進行上樣。把蒲公英水提醇沉后的沉淀物溶解液加入到已裝好的大孔樹脂柱中，確保藥液液面高于樹脂柱上表面2 cm，靜置吸附0.5 h；然后用蒸餾水、25%乙醇、50%乙醇、75%乙醇洗脫至無色，在洗脫過程中流速控制為3 BV/h，每一瓶接200 mL洗脫液；最后濃縮至含藥量1 g/mL，裝入EP管中，每個樣品分別標記：水X部位，25%乙醇X部位，50%乙醇X部位，75%乙醇X部位，X為每瓶洗脫液收集的次序。

1.3 樣品A、B、C體外抗病毒試驗法 參照顏娓娓等[15]的試驗方法，進行MA104細胞的復蘇、培養以及RSV、HSV、EV-71三種病毒的擴增。

1.3.1 病毒毒力的測定 用 2% 維持液將病毒液做10倍比系列稀釋，縱向重復3孔，橫向依次接種在96孔板內單層細胞上，37 ℃、5% CO2培養，細胞出現病變者判為藥物毒性，終止培養，中性紅染液染色后，用酶標儀在540 nm波長條件下測定OD值。結合Reed-Muench公式計算病毒液的半數感染濃度(TCID50)。細胞存活率=各組OD值/正常細胞OD值×100%，細胞病變率=1-細胞存活率，細胞比距= (高于50%病變率-50%)/(高于50% 病變率-低于50%病率)×100%，TCID50=Antilog(log高于50% 病變率病毒稀釋度+ 細胞比距×稀釋因子對數)。

1.3.2 蒲公英樣品細胞毒性及其抗病毒活性觀察 ①蒲公英樣品半數中毒濃度(TC50)的測算：將樣品用2% 1640維持液按2倍比稀釋12個濃度梯度，依次接種于已經長成單層MA104細胞的96孔板中，并設3個復孔，同時設置細胞對照組。置于37 ℃、5% CO2病毒培養箱中培養，在倒置顯微鏡下觀察，當細胞出現90%病變時終止培養。將96孔板中的培養液吸出，每孔加入中性紅染液50 μL，放入培養箱中反應1 h取出，倒出中性紅染液，用自來水沖洗5遍，每孔加入100 μL脫色液，恒溫箱放置15 min，用酶標儀在540 nm波長下測定OD值。結合 Reed-Muench 公式計算藥物半數中毒濃度(TC50)，并確定藥物最大無毒濃度(TC0)。本實驗以細胞存活率≥90%的藥物濃度作為藥物最大無毒濃度。TC50= [Antilog ( log 高于50% 病變率病毒稀釋度-細胞比距)]×C首孔藥物濃度。②蒲公英樣品半數有效濃度(EC50)和治療指數(TI)的測算：將樣品用2%1640維持液分別進行2倍比稀釋，共12個稀釋度，按稀釋度順序以每孔50 μL橫向接種于長成單層的MA104細胞的96孔板中，每孔再加50 μL用2% 1640稀釋過的病毒，設3個復孔，同時設病毒對照和細胞對照組。置于37 ℃、5% CO2病毒培養箱中培養，每日觀察病變。用倒置顯微鏡觀察，當病毒對照組出現90%以上病變時，終止培養。將96孔板中的培養液吸出，每孔加入中性紅染液50 μL，放入培養箱中反應1 h取出，倒出中性紅染液，用自來水沖洗5遍，每孔加入100 μL脫色液，恒溫箱放置15 min，用酶標儀在540 nm波長下測定OD值。結合Reed-Muench公式方法計算EC50和TI。EC50=[Antilog(log高于50%存活率藥物稀釋度的值-細胞比距)]×C首孔藥物濃度，TC50=[Antilog(log高于50%病變率藥物稀釋度的值-細胞比距)]×C首孔藥物濃度，TI=TC50/EC50，當TI≥4時，則認為藥物具有抗病毒活性，否則無效。樣品A結果： RSV病毒TC50、EC50、TI分別為 2-4.6、2-8.7、17.15，EV-71病毒TC50、EC50、TI分別為2-4.8、2-11.0、73.50，樣品對HSV病毒無抑制作用。說明樣品A對RSV病毒和EV-71病毒均有一定的抑制效果，對EV-71病毒有著明顯的抑制作用。經過初步篩選，選用EV-71病毒進行下一步樣品B、C抗病毒有效部位的研究。

1.4 樣品B、C抗病毒有效部位的篩選 樣品B、C分別進行體外抗EV-71病毒實驗，方法同1.3。用酶標儀測定OD值，計算TI值。樣品B體外抗EV-71病毒的TC50為2-4.5，TI值顯示無效。樣品C體外抗EV-71病毒的TC50、EC50、TI分別為2-4.4、2-10.2、55.72，提示樣品C對EV-71病毒有良好的抑制性。樣品B對病毒沒有抑制效果，故選用樣品C進一步探究其抗病毒具體部位。將樣品C溶解后過D101大孔吸附樹脂，分別以蒸餾水、25%乙醇、50%乙醇、75%乙醇為洗脫劑進行洗脫，收集洗脫液后進行體外抗EV-71病毒實驗。最終樣品D作為研究樣本初步探究蒲公英體外抗EV-71病毒的作用。

1.5 樣品D抗EV-71病毒作用觀察 參照袁琦等[16]的實驗方法，設置抗病毒作用中的預防作用組、直接殺滅作用組、病毒穿入細胞后的阻斷作用組。

1.5.1 樣品D抗EV-71病毒預防作用觀察 樣品D從無毒濃度起，用2%1640維持液進行2倍比稀釋，共12個稀釋度，按稀釋度順序以每孔50 μL橫向接種于長成單層的MA104細胞的96孔板中，2 h后，用PBS進行清洗，每孔再加入50 μL 100倍TCID50濃度的病毒液，并設3個復孔，同時設置細胞對照組和病毒對照組[16]。后續培養方法及TI值測定方法同1.3.2②。

1.5.2 樣品D抗EV-71病毒的直接殺滅作用觀察 樣品D從無毒濃度起，用2%1640維持液進行2倍比稀釋，共12個稀釋度，與等體積100倍TCID50 濃度的病毒液相互作用2 h，每孔50 μL橫向接種于長成單層的MA104細胞的96孔板中，并設3個復孔，同時設置細胞對照組和病毒對照組。TI值測定方法同1.3.2②。

1.5.3 樣品D對EV-71病毒穿入細胞的阻斷作用觀察 向已經長成單層的MA104細胞的96孔板中加入50 μL 100倍TCID50濃度的病毒液，2 h后，用PBS清洗，將樣品D從無毒濃度起，用2%1640維持液進行2倍比稀釋，共12個稀釋度，每孔50 μL接種，設3個復孔，同時設置細胞對照組和病毒對照組。TI值測定方法同1.3.2②。

2 結果

2.1 蒲公英樣品C經不同溶劑洗脫后抗EV-71病毒有效部位的篩選結果 水1部位TC50、EC50、TI分別為2-5.0、2-11.2、73.52，水2部位分別為2-4.7、2-9.7、32.00，水3部位分別為2-4.5、2-8.6、17.15，水4部位分別為2-4.9、2-8.1、9.19。水4、5、6、7、8部位無抗病毒作用。25%乙醇1部位TC50、EC50、TI分別為2-4.6、2-8.0、10.56。25%乙醇2、3、4、5、6、7部位無抗病毒作用。50%乙醇1部位TC50、EC50、TI分別為2-3.5、2-6.3、6.96。50%乙醇2、3、4、5、6部位無抗病毒作用。75%乙醇1、2、3部位無抗病毒作用。樣品C經D101型大孔樹脂吸附后的水1洗脫部位(樣品D)為抗EV-71病毒最有效部位。

2.2 樣品D的抗EV-71病毒機制 預防作用組TC50 、EC50 、TI分別為2-2.5、2-6.9、24.25。阻斷作用組TC50 、EC50 、TI分別為2-2.2、2-4.6、5.28。直接殺滅組無抗病毒作用。預防作用組TI值大于阻斷作用組(P<0.05)。

3 討論

EV-71病毒是引起手足口病最為常見的病毒之一。人類作為EV-71病毒惟一的自然宿主，感染后容易引發肺水腫、心肌炎、無菌性腦膜腦炎等嚴重并發癥，更為嚴重者甚至死亡。目前臨床上治療EV-71病毒感染的疾病主要藥物是利巴韋林。但利巴韋林毒性大，會逐漸產生耐藥性。中藥具有不良作用小、廣譜抗病毒、作用靶點多、價格低廉、藥源豐富等優點，因此，尋找對病毒有效的中藥為近年研究熱點。

蒲公英作為一種藥食同源的藥物，其化學成分主要有黃酮類、植物甾醇類、香豆素類、倍半萜類、揮發油類、多糖類等，在臨床上主要應用于呼吸系統感染、皮膚病、胃腸道疾病、糖尿病、婦科病等疾病，已經成為科研界關注的焦點，蒲公英的多種藥理活性與化學成分的研究為新的天然藥物開發提供了藥理學依據[16]。查閱國內外文獻發現，蒲公英具有抗流感病毒和人類免疫缺陷病毒(HIV)的活性。He等[17]研究發現蒲公英水提物的一個或多個組分具有抗流感病毒的特性，其作用機制主要是抑制病毒復制。Han等[18]研究發現，蒲公英提取物具有抗HIV-1復制和抑制逆轉錄酶活性的作用。目前，國內外對蒲公英抗腸道病毒的研究未見報道。本研究通過體外抗病毒實驗對蒲公英水提液(樣品A)抗病毒的有效部位進行初步篩選，確定其最敏感菌株為腸道EV-71病毒，采用水提醇沉法進一步對樣品A分離純化，得到樣品B(上清液)和樣品C(沉淀)，發現沉淀部位具有抗病毒活性。再進一步通過大孔樹脂吸附的方法進行純化，得到不同洗脫部位的樣品，最終確定其最有效部位為經過50%乙醇醇沉后，沉淀部位溶解后經D101型大孔吸附樹脂吸附，水1洗脫部位。本研究中利用蒸餾水回流提取法制備蒲公英水提液，可以將其黃酮類、多糖類等成分提取出來，研究發現黃酮類和多糖類物質均具有一定的抗病毒活性，提示此提取方式適合其抗病毒研究。樣品C經D101大孔吸附樹脂吸附，并選擇不同梯度的極性溶劑進行洗脫，可以將活性成分分離純化，并有效去除雜質，從而進一步研究其抗病毒有效物質。

對蒲公英最有效部位體外抗病毒作用進一步探究發現蒲公英體外抗EV-71病毒機制中的預防作用要明顯優于病毒穿入細胞的阻斷作用，可以推測蒲公英可以提高細胞的免疫能力，對EV-71病毒的穿入有一定的抑制作用，減弱了病毒對細胞的進攻，但在細胞內無直接殺傷作用。將病毒和藥物直接作用時，TI值顯示無效，進一步說明了蒲公英對EV-71病毒無直接殺滅作用。宋寶輝等[19]探討了蒲公英及其多糖提取物對免疫功能低下小鼠的影響，發現蒲公英及其多糖提取物具有上調機體免疫功能低下的作用，說明蒲公英可以提高細胞的免疫力。國內對中草藥抗EV-71病毒機制的研究發現，其具有直接殺滅病毒的作用。王春陽等[20]通過MTT染色法探究了魚腥草對EV-71病毒的活性，發現其在體外具有與利巴韋林相當的抗EV71病毒復制的活性，并且魚腥草可以直接滅活EV-71病毒。由于中藥抗病毒具有多成分、多環節、多靶點的特點。蒲公英水提液抗EV-71病毒作用機制較為復雜，并不是針對于病毒感染的某一單一環節，可能是藥物對細胞和病毒的多種功效共同發揮作用，其抑制病毒感染的詳細機制，需要進一步試驗驗證。盡管病毒的整個復制周期尚未完全研究清楚，但其關鍵步驟主要包括病毒吸附、穿入、生物合成、復制、裝配與釋放幾個過程，這些關鍵的步驟都可成為抗病毒藥物研究的作用靶點[21]。

綜上所述，蒲公英水提液具有良好的抗EV-71病毒活性，其抗病毒最有效部位為經過50%乙醇醇沉后，沉淀部位溶解，經D101型大孔吸附樹脂吸附，水1洗脫部位。蒲公英最有效部位體外抗EV-71病毒作用中的預防作用優于病毒穿入細胞的阻斷作用，對EV-71病毒并沒有直接殺滅作用。本研究也為進一步分離、純化、篩選出蒲公英抗EV-71病毒作用的有效單體提供了實驗基礎。