基于腸道益生菌的中藥防治疾病作用研究進(jìn)展＊

趙 鑫，付志飛，高秀梅

（天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院方劑學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 天津 301617）

哺乳動物的胃腸道內(nèi)有大量不同數(shù)量的微生物群落，稱為腸道菌群[1]。腸道益生菌是指腸道內(nèi)的活的微生物，當(dāng)補(bǔ)充足夠數(shù)量時，有助于保護(hù)腸道及身體健康，表現(xiàn)為改善腸道菌群和腸內(nèi)微環(huán)境，增強(qiáng)免疫功能，預(yù)防或治療腹瀉、便秘、腹脹氣等腸道疾病，有助于營養(yǎng)吸收、調(diào)節(jié)因腸道菌群失調(diào)造成的代謝異常（骨代謝和糖脂代謝等）[2]。中醫(yī)藥對腸道菌群的調(diào)控研究已成為中醫(yī)藥研究的熱點(diǎn)[3-7]。其中，中藥在促進(jìn)腸道益生菌尤其是雙歧桿菌（Bifidobacterium）和乳桿菌（Lactobacillus）的生長、調(diào)節(jié)腸道菌群紊亂等方面作用顯著[8,9]。此外，腸道益生菌對中藥成分的代謝而產(chǎn)生具有藥理活性的物質(zhì)，也為開展中藥代謝研究提供參考[7,10]。本文聚焦腸道益生菌，匯總其對中藥防治疾病作用機(jī)制的研究，為中醫(yī)藥的腸道菌群作用靶點(diǎn)及機(jī)制研究提供理論依據(jù)，并結(jié)合現(xiàn)代醫(yī)藥發(fā)展前沿，為益生菌應(yīng)用于中藥的前景進(jìn)行分析，為臨床合理用藥提供參考。

1 腸道益生菌在疾病防治中的重要性

1.1 腸道益生菌與骨質(zhì)疏松

益生菌對骨質(zhì)疏松的防治作用研究主要圍繞益生菌對腸道菌群及免疫調(diào)節(jié)作用等方面展開，并取得了一定的成果[11]。益生菌通過生產(chǎn)抗菌活性物質(zhì)抑制致病微生物的生長，來調(diào)節(jié)腸道菌群平衡，進(jìn)而改善骨代謝[12,13]。如用枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）喂養(yǎng)母雞可提高其脛骨厚度，還可有效預(yù)防沙門氏菌（Salmonella）感染導(dǎo)致的骨量減少[14]。另外，益生菌對免疫具有一定的調(diào)節(jié)作用，通過刺激免疫細(xì)胞分泌細(xì)胞因子，提高機(jī)體細(xì)胞免疫力而防治骨質(zhì)疏松[15]。對雌激素缺乏的去勢小鼠進(jìn)行羅伊氏乳桿菌（Lactobacillus reuteri）灌胃飼養(yǎng)后，與未進(jìn)行益生菌干預(yù)組相比，骨標(biāo)志物及免疫因子表達(dá)量明顯提高，依此推測羅伊氏乳桿菌可能通過調(diào)節(jié)小鼠腸道菌群及免疫功能來改善骨代謝[11,16]。最新研究發(fā)現(xiàn)，鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）可使腸道中梭菌綱豐度上升，產(chǎn)生更多丁酸，進(jìn)而使小鼠腸道和骨髓中調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞增多，活化成骨細(xì)胞相關(guān)的信號通路，最終刺激骨生成[17]。也有研究表明益生元通過增加腸道益生菌含量，進(jìn)而增加骨的礦化作用，增強(qiáng)骨密度，促進(jìn)物質(zhì)元素的吸收[18]。

1.2 腸道益生菌與肥胖、糖尿病

研究表明，高脂飲食可能會引起腸道菌群失調(diào)，進(jìn)而導(dǎo)致肥胖和糖尿病等代謝性疾病。與肥胖相關(guān)的腸道菌群組成模式，通常用厚壁菌門/擬桿菌門的比值（Firmicutes/Bacteroidetes）來反映。與對照組相比，肥胖者的F/B的比值增大，腸道菌群多樣性較低[19,20]。動物實(shí)驗(yàn)顯示，乳桿菌或雙歧桿菌給藥后脂肪組織質(zhì)量減少，且通過調(diào)節(jié)肝臟中的生脂和脂解基因的表達(dá)、降低肝臟脂肪變性、改善血脂和葡萄糖耐受性、降低內(nèi)毒素血癥以及調(diào)節(jié)炎癥等途徑來緩解肥胖[21]。臨床研究表明，肥胖及代謝性疾病患者口服活菌制劑或益生元后體重降低，推測益生菌在腸道定植后參與到脂肪分解代謝過程而發(fā)揮降低體重功效[22]。此外，益生菌在防治糖尿病方面也有廣闊前景。將多菌株益生菌給予2 型糖尿病患者后，表現(xiàn)為糖化血紅蛋白和瘦素的水平降低，葡萄糖耐受性提高，保護(hù)胰腺免受損傷，且具有降低空腹和餐后血糖水平和改善胰島素抵抗的有益作用[23]。臨床實(shí)驗(yàn)研究顯示，加氏乳桿菌（Lactobacillus gasseri）可以有效減輕體重，而“高脂飲食”會減少小腸中的加氏乳桿菌，并破壞ACSL3-脂肪酸感受過程，從而影響血糖代謝平衡，這也是體重增加的一個原因，而補(bǔ)充加氏乳桿菌，可以發(fā)揮幫助糖尿病人進(jìn)行血糖調(diào)控的作用[24]。

1.3 腸道益生菌與心血管疾病

腸道菌群失調(diào)不僅引起代謝性疾病，代謝紊亂還會引起包括高血壓、動脈粥樣硬化等心血管疾病。研究表明，腸道菌群失衡促進(jìn)高血壓的發(fā)生，且用益生菌或其發(fā)酵產(chǎn)品干預(yù)后，可以調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)，高血壓狀態(tài)也得以改善。用鼠乳桿菌（Lactobacillus murinus）干預(yù)小鼠后，其輔助性T細(xì)胞17（T helper cell 17,Th17）細(xì)胞減少，可預(yù)防誘導(dǎo)型和鹽敏感性高血壓發(fā)生。同時臨床研究發(fā)現(xiàn)，鹽攝入量與TH17 細(xì)胞量和血壓值成正比，而且腸道中多種乳桿菌屬益生菌減少[25]。關(guān)于益生菌降壓的機(jī)制，有產(chǎn)生肽類等降壓物質(zhì)或短鏈脂肪酸的作用，改善血管氧化和炎癥水平等[26]。此外，益生菌的添加還能夠改變腸道菌群的組成，從而影響動脈粥樣硬化的發(fā)展。在實(shí)驗(yàn)研究中，通過對載脂蛋白E（apolipoprotein E，ApoE）基因敲除小鼠注射噬酸乳桿菌（Lactobacilus acidophilus）ATCC4356，有效減少了氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，進(jìn)而抑制動脈粥樣硬化的病變發(fā)展[27]。此外，乳桿菌、雙歧桿菌等有益菌能降低膽固醇及有害物質(zhì)氧化三甲胺（Trimetlylamine oxide，TMAO）的水平，繼而降低心血管疾病的發(fā)生[28,29]。短鏈脂肪酸乙酸酯作為腸道益生菌的主要代謝產(chǎn)物之一，它的產(chǎn)生和分布可以解釋膳食纖維在心血管疾病的發(fā)展中起到的有益作用，且醋酸鹽影響并改善心血管健康和功能相關(guān)分子的變化[30,31]。

2 中藥與腸道益生菌的相互作用

2.1 中藥對腸道益生菌生長促進(jìn)作用

中藥復(fù)方或單味中藥諸多研究發(fā)現(xiàn)，中藥及復(fù)方具有促進(jìn)腸道益生菌的生長、調(diào)節(jié)腸道菌群失調(diào)的作用。中藥復(fù)方健脾滲濕湯，參苓白術(shù)散，四君子湯，理中湯在治療脾虛時，小鼠腸道中乳桿菌和雙歧桿菌含量顯著提高；七味白術(shù)散，健脾益腸湯和補(bǔ)中益氣湯通過扶植小鼠腸道益生菌生長而緩解腸道菌群失調(diào)；芪黃口服液在治療肝硬化過程中，患者腸道菌群中乳桿菌和雙歧桿菌也同樣含量提高；葛根芩連湯也可使肥胖和糖尿病患者腸道中雙歧桿菌含量增加[4]。此外，單味中藥人參，黃連素，金銀花，麻黃堿，熟地黃，艾葉和大黃素均對不同疾病模型的腸道菌群中乳桿菌等腸道益生菌具有增殖作用[3]。楊君以保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus）和嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）為菌株，研究中草藥對乳酸菌生長的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這兩種菌于生地黃、阿膠、綠茶茶葉和黨參藥液中生長良好[8]。杜仲水提物在適當(dāng)濃度下可促進(jìn)嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）的增殖及其胞內(nèi)外蛋白的分泌[9,32]。

2.2 中藥聯(lián)合腸道益生菌對有害菌的抑制作用

迄今為止，國內(nèi)外已對大量單味中藥及中藥單體進(jìn)行了抗菌試驗(yàn)，證實(shí)多種中藥具有直接抗菌作用，如黃連、金銀花、大黃、夏枯草等對金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）具有較好的抑制作用[33,34]。中藥復(fù)方葛根芩連湯對金黃色葡萄球菌、肺炎雙球菌（Diplococcus pneumoniae）和 痢 疾 桿 菌（Shigella dysenteriens）均有抑菌作用[35]。艾葉、苦參、花椒、蒼耳子、苦諫皮和露蜂房6 味中藥組成的復(fù)方對金黃色葡萄球菌、白色念珠菌（Candida albicans）及大腸桿菌（Escherichia coli）具有較強(qiáng)的抑菌活性[36]。中藥對有害菌的抑制的同時，間接增加了有益菌在腸道菌群中的豐度。此外，中藥的抑菌作用也表現(xiàn)在通過促進(jìn)益生菌的生長，在其與益生菌的聯(lián)合作用下，抑制有害菌的生長而維持腸道微生態(tài)平衡[13]。研究證實(shí)，在適宜的臨床劑量下，杜仲葉可通過促進(jìn)益生菌保加利亞乳桿菌的生長來實(shí)現(xiàn)對致病菌金黃色葡萄球菌的抑制，優(yōu)化腸道菌群結(jié)構(gòu)，并發(fā)揮其補(bǔ)益作用[37]。

2.3 腸道益生菌對中藥的代謝作用

中藥大多采用口服方式進(jìn)入消化道。在消化道內(nèi)，難以吸收并且滯留時間較長的中藥成分可能通過腸道菌群進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，因此開展腸道菌群對中藥代謝作用的研究意義重大[38-40]。益生菌通過分泌酶類物質(zhì)，提高中藥藥效成分的生物利用度而提高藥效[41]。例如，益生菌分泌的糖苷酶可將苷類化合物轉(zhuǎn)化成苷元，如芍藥苷是芍藥的主要活性成分，通過被腸道益生菌產(chǎn)生的β-葡萄糖苷酶和酯酶催化為芍藥苷元，從而更好的發(fā)揮藥效[10]。芍藥苷與脆弱擬桿菌（Bacteroides fragilis）或短乳桿菌（Lactobacillus brevis）共同培養(yǎng)后，產(chǎn)生了藥物活性物質(zhì)芍藥苷元和芍藥代謝素[42]。黃酮類化合物葛根黃素通過糞腸球菌（Enterococcus faecalis）和雙歧桿菌的代謝作用得到大豆苷元[43]。生物堿類化合物烏頭堿通過脆弱擬桿菌和丁酸梭菌（Clostridium butyricum）代謝后，得到毒性較弱的脂烏頭堿[44]。因此，開展腸道益生菌對中藥中有效成分的生物轉(zhuǎn)化研究是提升中藥藥效的重要途徑之一，探索其菌轉(zhuǎn)化機(jī)制不僅為中藥的腸道菌群靶點(diǎn)研究提供理論基礎(chǔ)，也為中藥藥理研究提供指導(dǎo)意義。

3 中藥與腸道益生菌相互作用研究方法

3.1 高通量測序法

高通量基因測序技術(shù)的發(fā)展以及強(qiáng)大的生物信息學(xué)分析工具的開發(fā)，為研究中藥與腸道菌群的相互作用提供了新的思路。該方法通過對樣品中所有微生物的DNA 進(jìn)行整體提取、測序，在很大程度上為環(huán)境中不可培養(yǎng)微生物和痕量菌的研究提供了新的思路[45,46]。相比于傳統(tǒng)焦磷酸測試技術(shù)，Illumina測序技術(shù)具有通量更高、錯誤率更低、成本更低等優(yōu)勢，從而成為宏基因組測序市場的主流。大多數(shù)研究通過高通量測序技術(shù)對人或小鼠糞便菌群進(jìn)行整體多樣性分析，得出中藥作用的靶點(diǎn)菌群（菌）。臨床應(yīng)用上，采用高通量測序技術(shù)研究葛根芩連湯治療2型糖尿病濕熱證的療效及對患者腸道菌群的影響，結(jié)果顯示葛根芩連湯聯(lián)合西藥可有效治療濕熱證2型糖尿病，擬桿菌（Bacteroides）和梭桿菌（Fusobacterium）含量變化可作為療效觀察的標(biāo)志物[47]。也有研究采用高通量測序結(jié)合藥理學(xué)及藥代動力學(xué)分析，對中藥的腸道菌群藥理及代謝機(jī)制進(jìn)行研究。文獻(xiàn)[5]中研究了中藥復(fù)方中的多糖成分對模型小鼠腸道菌群和內(nèi)源性代謝物的影響，以及該條件下的菌群對人參皂苷的作用[48]。

3.2 實(shí)時熒光定量PCR法

實(shí)時熒光定量PCR 技術(shù)是一種在PCR 反應(yīng)體系中加入熒光標(biāo)記物，依托模板擴(kuò)增產(chǎn)物的量與熒光強(qiáng)弱程度的正比關(guān)系，對熒光信號進(jìn)行實(shí)時計(jì)量而對目的基因進(jìn)行定量分析的方法[46]。該技術(shù)主要針對樣品中某些特定菌種進(jìn)行定量研究，如益生菌。有文獻(xiàn)報(bào)道，實(shí)時熒光定量PCR方法用于檢測雙歧桿菌等益生菌對小鼠腸道菌群的改善作用[49]。應(yīng)用實(shí)時熒光定量PCR法對灌胃不同配伍比例的附子和紅參的大鼠糞便中的總菌、乳桿菌和擬桿菌的相對含量進(jìn)行檢測分析，當(dāng)附子和紅參的配伍比例為1∶2 時，能在一定程度上改善腸道的微生態(tài)環(huán)境，促進(jìn)有益菌的生長[50]。熒光定量PCR法往往與高通量測序相結(jié)合，對高通量測序結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。研究甜櫻桃對肥胖小鼠腸道菌群影響時發(fā)現(xiàn)，乳桿菌和腸桿菌豐度的16S 測序結(jié)果與PCR驗(yàn)證結(jié)果一致[51]。

3.3 腸道益生菌的傳統(tǒng)分離、培養(yǎng)法

腸道益生菌的篩選分離主要根據(jù)中藥與腸道菌群的相關(guān)性分析基礎(chǔ)上，通過最佳培養(yǎng)基的使用，聯(lián)合微生物生理生化及分子生物學(xué)方法對腸道益生菌進(jìn)行分離、鑒定。其中，抗菌活性被認(rèn)為是益生菌競爭性地捧除或抑制腸道中有害致病微生物的一個重要的手段。益生菌產(chǎn)生抗菌化臺物包括有機(jī)酸或具有殺菌或抗菌活性的肽和蛋白[52,53]。因此抑菌活性是對腸道益生菌篩選的必要條件。由于許多物質(zhì)具有相對窄的抑菌譜，篩選期間抗菌活性檢測具有十分重要的作用，指示菌的挑選十分關(guān)鍵。隨后，將中藥與腸道益生菌共培養(yǎng)，繪制生長曲線。對具有抑菌活性的中藥測定最小抑菌濃度，對具有促進(jìn)生長作用的中藥測定最適生長濃度，并進(jìn)一步研究相互作用機(jī)制。結(jié)合高通量測序，采用傳統(tǒng)微生物實(shí)驗(yàn)法從泰國志愿者腸道中分離鑒定出的益生菌芽孢桿菌后，對其抑制病原菌金黃色葡萄球菌的腸道定植的分子機(jī)制進(jìn)行了研究[54]。還有研究者從健康豬腸道食糜中篩選到l 株能抑制大腸埃希菌、副傷寒沙門菌、金黃色葡萄球菌和巴氏桿菌生長的芽孢桿菌AP139，其與中草藥五倍子具有協(xié)同抑菌作用[55]。

3.4 糞菌移植法

糞菌移植是一種將健康供體糞便中的功能菌群移植到疾病受體胃腸道內(nèi)，重建具有正常功能腸道菌群的技術(shù)，以此來實(shí)現(xiàn)對腸道內(nèi)、外疾病的治療[56]。目前報(bào)道糞菌移植已應(yīng)用于臨床艱難梭菌感染、炎癥性腸病、腸易激綜合征、代謝綜合征等多種疾病的治療中[57]。基于高通量測序以及關(guān)聯(lián)代謝譜分析結(jié)果，確定中藥作用的功能菌群，即靶點(diǎn)腸道益生菌，通過特定培養(yǎng)條件對目的菌株進(jìn)行體外分離、純化和鑒定。將分離得到的目的菌株進(jìn)行體外培養(yǎng)或?qū)⒎弥兴幍膭游锛S便，通過灌胃到動物腸道內(nèi)，從而達(dá)到糞菌移植的目的，改善腸道菌群。抗生素的使用破壞了小鼠腸道微生態(tài)的動態(tài)平衡，且降低了小鼠腸道菌群的多樣性，而復(fù)合菌（雙歧桿菌、植物乳桿菌和嗜酸乳桿菌）液對小鼠腸道菌群的恢復(fù)具有明顯的作用[58]。益生菌灌胃治療疾病小鼠也已應(yīng)用到骨質(zhì)疏松、糖尿病、肥胖、心血管疾病研究中[17,24,25]。同時，糞菌移植也是中醫(yī)藥基于腸道菌群的靶點(diǎn)機(jī)制研究的重要驗(yàn)證手段。通過研究旱蓮草對骨質(zhì)疏松小鼠腸道菌群影響，將高通量測序得到的靶點(diǎn)益生菌乳桿菌和乳球菌進(jìn)行體外培養(yǎng)后灌胃到骨質(zhì)疏松小鼠中，小鼠的骨質(zhì)疏松和腸道菌群均得到了改善，為旱蓮草通過腸道菌群防治骨質(zhì)疏松的作用機(jī)制研究提供理論依據(jù)[59]。此外，為找到靈芝水提物通過腸道菌群緩解肥胖的證據(jù)，將喂養(yǎng)靈芝水提物的小鼠糞便移植給高脂飲食小鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與直接喂食靈芝水提物效果相似[6]。

4 展望

近年來，蛋白質(zhì)組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、宏基因組學(xué)及代謝組學(xué)等“組學(xué)”技術(shù)蓬勃發(fā)展。該類“組學(xué)”技術(shù)對中藥經(jīng)腸道作用過程中涉及的靶點(diǎn)菌的挖掘、篩選和鑒定具有重要意義。益生菌是腸道菌群的重要組成部分，對腸道微生態(tài)平衡具有調(diào)節(jié)作用，中藥可以通過促進(jìn)益生菌的生長來發(fā)揮藥效作用；同時，中藥經(jīng)腸道內(nèi)益生菌生物轉(zhuǎn)化，其有效成分的生物利用度和藥效可以得到提高，兩者相輔相成。開展中藥基于腸道益生菌的疾病防治作用研究，有利于輔助佐證中藥復(fù)方配伍的合理性和科學(xué)內(nèi)涵，進(jìn)而為中藥聯(lián)合腸道益生菌新藥的研制開發(fā)提供理論指導(dǎo)和應(yīng)用前景。