肌球蛋白輕鏈磷酸酶靶向亞基1在調節血管張力中的作用的研究進展*

劉小勤 楊艷

(西南醫科大學心血管醫學研究所醫學電生理學教育部和四川省重點實驗室、四川省心血管疾病防治協同創新中心，四川 瀘州 646000)

血管張力調節是收縮與舒張的動態平衡，血管收縮主要通過肌球蛋白輕鏈激酶(Myosin lightchain kinase，MLCK)調節肌球蛋白輕鏈磷酸化實現，血管舒張主要通過肌球蛋白輕鏈磷酸酶(Myosin light chain phosphatase，MLCP)使肌球蛋白調節輕鏈(Myosin regulatory light chains，RLC)去磷酸化實現。MLCP是調節血管信號的關鍵分子。MLCP是異源三聚體蛋白磷酸酶，由肌球蛋白靶向亞基(Myosin phosphatase targeting subunit，MYPT)、38kDa催化亞基(Catalytic subunit of protein phosphatase type 1，PP1cδ)和功能未知的21kDa小亞基組成[1]。MLCP作為ROCK(Rho-associated protein kinase，ROCK)和NO/cGMP/PKG(Nitric oxide，NO；cGMP-dependent protein kinase，PKG)途徑的下游靶標，其活性決定肌球蛋白調節輕鏈磷酸化狀態以調節血管張力?，F就MYPT1在調節血管張力中的研究進行闡述。

1 肌球蛋白磷酸酶靶向亞基結構

肌球蛋白磷酸酶靶向亞基是Hubbard和Cohen在1993年發明。MYPT有MYPT1、MYPT2、MYPT3、85kDa蛋白磷酸I肌球蛋白結合亞基(Protein phosphatase 1 myosin binding-subunit of 85 kDa，MBS85)和TGF-β1抑制的膜相關蛋白(TGF-β1-inhibited，membrane-associated protein，TIMAP)。MYPT1由1032個氨基酸組成，靠近N末端有一個RVxF基序(結合催化亞基PP1cδ位點)和幾個錨蛋白重復序列，中心區域是酸性和絲氨酸/蘇氨酸結構域，靠近C端是亮氨酸拉鏈(Leucine zipper，LZ)可變剪接結構域[3]。MYPT1家族主要中心(Central insert，CI)外顯子及LZ外顯子可變剪接[1]，可表達8種亞型[4]；MYPT1也具有多個可磷酸化位點。目前研究集中于亮氨酸拉鏈可變剪接和絲氨酸/蘇氨酸結構域與血管張力調節作用。

2 MYPT1亞型與相關生理病理狀態

2.1 MYPT1亞型

哺乳動物的CI外顯子亞型轉換相對保守。雖然特異性外顯子可變剪接保守，但幾乎所有物種MYPT1的CI外顯子能產生可變剪接[5]，但該區域可變剪接功能尚不明確。對不同物種的MLCP組成進行克隆和測序，確定MYPT1亞型[3,6]。近些年，主要研究MYPT1轉錄子LZ可變剪接。其剪接包含外顯子24(Exon 24，E24；鳥類的外顯子23，E23)，改變MYPT1轉錄子閱讀框架并引入一個提前終止密碼子，導致C末端缺乏LZ結構。反之，則含有LZ結構。

2.2 MYPT1亞型相關的生理病理狀態

在發育和疾病狀態下，MYPT1亞型轉換與血管張力調節相關，影響血管收縮和NO/cGMP介導的血管舒張。研究發現，在生長的發育期和成年期，平滑肌表現慢時相收縮表型，表達MYPT1-E24/LZ+亞型。之后表現快時相收縮表型，表達MYPT1-E24/LZ-亞型。De Mey等建立二級腸系膜動脈(Second-order mesenteric artery，MA2)結扎的“高血流(High flow，HF)/低血流(Low flow，LF)”模型[7]，發現HF和LF-MA1恢復MYPT1-E24-/LZ+亞型，但LF-MA1恢復持久[8]。8-bromoguanosine 3,5′-cyclic-monophosphate(8-Br-cGMP，cGMP激動劑)引起LF-MA1更大舒張。John[9]等誘導小鼠平滑肌條件性敲除E24。單個E24等位基因(轉換為MYPT1-LZ+)可增強收縮MA1對diethylamine-NONOate(DEA/NO)和cGMP介導的血管舒張。兩個E24等位基因敲除沒有加強血管轉換為MYPT1-E24-/LZ+亞型。MA對MYPT1亞型移位具有高度敏感性。門靜脈高壓[15]和妊娠高血壓[10]血管MYPT1亞型有類似變化。在大鼠心肌梗死和充血性心力衰竭中主動脈和髂動脈MYPT1-LZ+亞型減少[11]。肺動脈高壓大鼠肺動脈MYPT1-LZ+表達上調，但總MYPT1量不變[12]。豬冠狀動脈狹宰且不運動會改變心外膜動脈(E24-/LZ+)和阻力小動脈(E24+/LZ-)MYPT1亞型[13]。在妊娠及分娩時，人子宮平滑肌MYPT1亞型表達發生變化[14]。總之，MYPT1亞型轉換影響NO/cGMP/PKG通路介導舒張效應。

3 MYPT1磷酸化位點與血管張力調節及相關生理病理狀態

3.1 MYPT1磷酸化位點與血管張力調節

MYPT1有近130個磷酸化位點參與其磷酸化[15-19]。MYPT1能增強PP1cδ與肌球蛋白結合的催化活性和特異性[20]。調節PP1cδ對RLC活性的MYPT1上多個磷酸化位點是調節收縮或舒張效應的調節點[21]。與調節血管張力有關的MYPT1磷酸化位點主要有：T697、T855、S696、S854、S669。ROCK磷酸化MYPT1-T697和T855位點[22]，磷酸化蘇氨酸位點結合至PP1cδ，抑制PP1cδ接近LC20底物以減弱MLCP活性[28]。在血管主動脈平滑肌細胞中，血管緊張素II，內皮素-1或(5Z)-7-[(1R,4S,5S,6R)-6-[(1E,3S)-3-Hydroxy-1-octenyl]-2-oxabicyclo[2.2.1]hept-5-yl]-5-heptenoic acid(U46619)明顯增加MYPT1-T696磷酸化水平[23]。MYPT1-T697/T855磷酸化與血管平滑肌收縮有關。S696和S854可被cAMP依賴性蛋白激酶(cAMP-dependent protein kinase，PKA)和PKG磷酸化[24]，作用于MLCP以引起舒張反應。ROCK相關位點磷酸化阻止PKA磷酸化S696和S854[25,26]，抑制MLCP活性以引起收縮反應。S669磷酸化速度比S696更快并且在MYPT1-S696處預磷酸化可以增強S669磷酸化率。S669磷酸化與NO/cGMP引起舒張效應有關，8-Br-cGMP處理的大鼠腦動脈pS696-MYPT1水平沒有增加[27]。Nakamura等[28]用cGMP刺激股動脈，其S696磷酸化增加，但雙磷酸化的pS696pT697-MYPT1沒有變化。S668是PKG作用MYPT1的新穎位點，PKG必須存在MYPT1-LZ結構域，使MYPT1-S668磷酸化并激活MLCP[29]。MYPT1通過與PP1c直接相互作用，或作用不同激酶磷酸化及可能影響RLC磷酸化蛋白質支架，在調節MLCP活性中發揮重要作用[1,30]。未來可將Phos-tag-SDS-PAGE蛋白質印跡與已驗證磷酸化特異性抗體結合，進一步研究PKG與MYPT1磷酸化位點如何整合以控制平滑肌中MLCP活性。

3.2 MYPT1磷酸化位點與生理病理狀態

老年雜合子MYPT1-T696A/+敲除小鼠基底動脈增加MLC20-S19和MYPT1-T853基礎磷酸化以抑制MLCP活性，具更高血管收縮反應性[31]。大鼠尾動脈遇冷，MYPT1-T855磷酸化增加[32]。雄性小鼠腦動脈收縮調節與MYPT1-T696、S695/S668磷酸化有關[33]。麻醉藥氟醚和異氟醚舒張KCl引起大鼠主動脈收縮，抑制MYPT1-T853磷酸化，不影響MYPT1-T696；舒張Ang II誘導大鼠主動脈收縮，抑制MLC和MYPT1-T853磷酸化[34]。DEA/NO抑制豬冠狀動脈MYPT1-T853磷酸化，直徑較大冠狀動脈對硝基類血管擴張劑響應更強，部分原因是PKG1和MYPT1活性增加[35]。糖尿病小鼠股動脈超收縮反應與MYPT1-T696/T853位點磷酸化增加有關，與MYPT1-S695位點磷酸化無關[36]。高原缺氧母羊肺動脈ROCK活性增加，即增加MYPT1-T696和T850磷酸化來抑制PKG作用[37]。在T696和T853(人序列)上的p-MRLC和p-MYPT1水平與張力水平一致[38]。

4 MYPT1亞型及MYPT1磷酸化位點與NO/cGMP/PKG

MYPT1-LZ+/-與NO/cGMP/PKG途徑介導血管舒張有關。當缺乏LZ時，PKG會直接結合MYPT1-LZ-[39]。當表達LZ時，NO下游的cGMP、PKG和MLCP活性增加，這需要PKG1α磷酸化MYPT1。這可能要形成MYPT1-LZ+/PKG復合物，改變MYPT1構象，影響MLCP活性。Huang QQ等證實MYPT1-LZ+是結合PKG1α-LZ和cGMP使MLCP活化必需的結構域[40]。MYPT1-LZ+表達降低的平滑肌細胞對NO敏感性降低[41]。研究證實MYPT1-LZ+對cGMP介導MLC20去磷酸化敏感性更強，使動脈松弛[9,42]。MYPT1亞型可能改變NO/cGMP介導血管舒張的敏感性。本課題組研究雄性成年自發性高血壓大鼠(Spontaneously hypertensive rats，SHR)和成年對照Wistar-Kyoto(WKY)大鼠，高血壓老年大鼠(SHR-old)和WKY老年大鼠(WKY-old)三級腸系膜動脈對NO供體硝普鈉(Sodium nitroprusside，SNP)的敏感性，在SNP濃度為10nM時，成年對照WKY大鼠三級腸系膜動脈對SNP的敏感性比其他三組動物高，但這是否與MYPT1亞型轉換有關，將進行進一步探索。

NO/cGMP/PKG1α途徑激活MLCP在平滑肌舒張中起重要作用。PKG引起平滑肌松弛，部分原因是MLCP增加LC20去磷酸化的速率[43]。PKG催化MYPT1-S695磷酸化，S695磷酸化不是直接激活MLCP[44]，而是通過阻止相鄰抑制性T696[24]磷酸化或通過激活使pMYPT1-T696去磷酸化的未知磷酸酶來激活MLCP。MYPT1-S695/T696磷酸化之間的拮抗作用促進MLCP抑制狀態的降低[24]。PKG對MYPT1磷酸化是由PKG與MYPT1-LZ+作用介導的[42]。MYPT1-LZ+是PKG1α高親和力底物。MYPT1亞型和磷酸化位點對于確定血管床對硝基異質反應是重要的，在健康和疾病下調節血管張力中起重要作用[45]。本課題組發現成年SHR、SHR-old、WKY-old與WKY大鼠相比，WKY大鼠MA3對SNP敏感性更強，機制研究發現成年SHR、SHR-old和WKY-old的MA3的可溶性環化酶1α、可溶性環化酶1β和PKG1α蛋白表達發生改變，MYPT1磷酸化位點情況將進一步研究。

5 展望

MYPT1是一種潛在的重要血管疾病治療靶點，已有研究表明MYPT1與疾病的相關性。MYPT1亞型轉換和MYPT1磷酸化條件多種多樣。由于難以確定作用特異性，靶向MYPT1以用于調節MLCP活性和平滑肌收縮尚未取得較大研究進展。MYPT1可變剪接結構可能具有較大潛力。MYPT1亞型轉換和磷酸化位點與血管張力作用需要繼續探索，靶向位點特異性MYPT1磷酸化的特異性分子值得進一步研究，這些工作將為治療心血管疾病探求到新靶點。