耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌流行病學、耐藥現狀、檢測方法及預防的研究進展

劉妍，元小冬，2，喬思佳，張萍淑，2，李佳慧，鄭慧

肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae，KP）是條件致病菌，其可導致重癥肺炎、敗血癥等并嚴重危及患者生命安全。有研究表明，對碳青霉烯酶敏感的KP感染致死率為20%～30%，而對碳青霉烯酶耐藥的KP感染致死率為40%～70%［1-2］。近年來隨著抗生素廣泛使用，臨床多重耐藥菌不斷增加［3］，耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌（carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae，CRKP）檢出率不斷升高，耐藥性不斷增強，且其耐藥基因可由質粒介導，通過轉化、接合、轉導等形式傳遞，形成多重耐藥菌，并可通過水平傳播的方式導致流行或暴發(fā)，因此KP耐藥性問題越來越嚴重。本文主要綜述了CRKP的流行病學、耐藥現狀、檢測方法及預防，以期為臨床有效防止CRKP提供參考。

1 流行病學

1997年MACKENZIE等［4］首次報道了CRKP，此后全球多個地區(qū)陸續(xù)出現了CRKP感染報道［5-7］。目前，世界范圍內有CRKP產肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶（KPC）、苯唑西林酶-48（OXA-48）、新德里金屬蛋白酶（NDM）等的播散［8］。研究顯示，西方國家多見CRKP產KPC-3型，我國多見CRKP產KPC-2型［9-11］。YIGIT等［12］于2001年首次報道美國北卡羅萊納州醫(yī)院中存在CRKP產KPC-1型；2007年我國浙江杭州地區(qū)發(fā)現KP產KPC-2型［13］；史瑋煬等［14］收集了上海交通大學醫(yī)學院附屬仁濟醫(yī)院2013年1月—2015年8月感染患者中CRKP共107株，均檢出KPC-2基因，提示KPC-2基因可能是CRKP感染的主要基因型。MONARI等［15］選取2014年8月—2015年1月意大利佩魯賈綜合醫(yī)院不同病房131株KP進行分析，發(fā)現至少對一種碳青霉烯類抗菌藥物具有耐藥性的KP有42株（32.1%），其中41株（97.6%）攜帶bla KPC基因。王鳳等［16］對2013—2017年中國人民解放軍總醫(yī)院內4 946株KP進行分析，發(fā)現710株CRKP，占14.4%，其中產KPC的CRKP占82.8%，且醫(yī)院CRKP比例由2013年的3.2%增至2017年的29.3%。

2 耐藥現狀及耐藥機制

2.1 CRKP耐藥現狀 隨著抗生素廣泛使用，KP的耐藥性不斷增強，特別是對碳青霉烯類抗菌藥物，這在很大程度上限制了碳青霉烯類抗菌藥物的應用［17］。碳青霉烯類抗菌藥物是治療多重耐藥革蘭陰性桿菌最有效的抗菌藥物，具有對β-內酰胺酶作用穩(wěn)定、毒性低等優(yōu)點。近年來KP對碳青霉烯類抗菌藥物耐藥現象廣泛存在，其全球耐藥率為20%～70%［18］。我國KP對碳青霉烯類抗菌藥物耐藥率從2005年的3%上升至2015年的15%，甚至達20%［19］，主要流行于浙江、江蘇、上海等地［20］。

OU等［21］收集中國中部醫(yī)院不同部位分離出的KP 955株，其中117株被鑒定為CRKP，占12.3%；2013—2015年CRKP分離率分別為8.9%、11.3%、16.2%，呈逐年增長趨勢，其中超過95%的CRKP對氨芐西林/舒巴坦、氨曲南、亞胺培南、頭孢他啶、哌拉西林等抗菌藥物耐藥。有研究表明，KP攜帶的耐藥基因中以SHV基因最常見，是KP對氨芐西林產生耐藥的主要遺傳學基礎，而攜帶qnr類基因的KP更易在患者之間進行傳播，進而引發(fā)醫(yī)院感染［22］。針對CRKP耐藥現象，臨床上應加強對KP基因型檢測，對不同基因型KP采取相應有效措施，同時應根據藥敏試驗結果選用敏感抗生素，盡量避免使用廣譜抗生素，以減少KP耐藥。

2.2 質粒在CRKP耐藥中的作用 質粒是獨立于細菌染色體之外能夠自我復制的DNA分子，攜帶耐藥基因的質粒能對氨基糖苷類、β-內酰胺類、喹諾酮類、大環(huán)內酯類等多種抗菌藥物產生耐藥性［23］。研究表明，質粒介導的耐藥基因可隨插入序列、轉座子等移動遺傳元件在細菌之間發(fā)生水平轉移［24］，因此質粒可導致CRKP耐藥性的擴散。

2.2.1 質粒耐藥機制 1957年AKIBA和OCHICI在試驗中發(fā)現，具有多重耐藥性的大腸埃希菌通過質粒接合并可以將耐藥性傳遞給較為敏感的志賀菌，此后世界各地也陸續(xù)報道了耐藥質粒的存在及其傳播［25］。細菌耐藥性的產生機制多為質粒可以通過接合方式傳遞獲得耐藥性基因，而基因環(huán)境中存在介導轉移的基因元件，因此質粒中攜帶的碳青霉烯酶基因更易于在不同細菌間轉移，導致碳青霉烯酶耐藥性廣泛傳播。不同的質粒之間還可以通過雜交方式攜帶更多外來獲得的耐藥基因，使其耐藥性不斷增加［26］，而相同型的質粒更容易在親緣關系相近菌株之間進行傳播［27］。此外，質粒還能通過捕獲外源性DNA而使細菌易于定植于新環(huán)境，其在細菌不斷進化、適應外界環(huán)境方面也起著重要的作用［28］。

2.2.2 質粒耐藥的流行 2003年GALIM等［29］在法國分離出一株耐氨基糖苷類藥物的KP，且相關耐藥基因可通過細菌質粒接合試驗傳播到其他菌株內。2009年，美國廣泛流行的CRKP產KPC中以碳青霉烯抗性肺炎克雷伯菌克隆序列258型（ST258）為主，且大量攜帶此基因的質粒是導致bla-KPC基因快速傳播的主要原因［30］。在以色列KP ST258菌株提取的不相容群Ⅱ型（IncF Ⅱ）質粒中發(fā)現KPC-3基因［31］，說明質粒在CRKP水平傳播與流行中起著重要作用。劉艷梅等［32］分析2015年神經重癥監(jiān)護室患者分離的31株KP發(fā)現，其均含有質粒并攜帶SHV基因，其中質粒中攜帶1種耐藥基因的KP 7株（22.6%），攜帶2種耐藥基因的KP 12株（38.7%），攜帶3種基因的KP 6株（19.4%），攜帶4種基因的KP 3株（9.7%），攜帶5種基因的KP 1株（3.2%），攜帶6種基因的KP 2株（6.5%），表明質粒中可同時攜帶多種耐藥基因且以SHV基因最常見，而質粒上攜帶耐藥基因種類多也是近年來質粒介導KP耐藥性廣泛流行的重要原因。

2.2.3 質粒的同源性 以質粒為基礎的同源性分析包括質粒圖譜和質粒酶切圖譜［33］。有研究表明，將一些菌株的質粒消除后，其耐藥性會變弱甚至消失，從而阻斷細菌耐藥性傳播［34］，但目前關于KP質粒同源性的研究報道較少，故可通過加強對質粒同源性研究而了解其水平傳播特點，以便于臨床及時阻斷、減少KP耐藥。

3 檢測方法

脈沖場凝膠電泳（PFGE）技術作為同源性檢測的“金標準”，常與多位點序列分型（MLST）聯(lián)用研究細菌之間親緣關系和相關性。近年來全基因組測序（WGS）較為流行，其可以確定細菌耐藥基因型、細菌來源、傳播途徑，對研究CRKP流行及耐藥具有重要意義。

3.1 PFGE PFGE的原理是將待測菌塊包埋于瓊脂塊中，用特異性內切酶對細菌染色體進行酶切，由于染色體DNA大小不同，因此其在交替改變的電場中速度也不同，進而呈現出不同條帶，最終根據條帶數目和位置比較細菌間同源性，完全相同者則為同一型［35］。楊竹蘭等［36］報道1例患者分離的CRKP并在該患者周圍環(huán)境中檢出4株KP，采用PFGE對其進行同源性分析結果顯示，周圍環(huán)境中有3株與患者電泳圖譜相同，1株與患者電泳圖譜相差2條條帶，證明患者及其周圍環(huán)境檢出了同一種CRKP，表明患者周圍環(huán)境是CRKP傳播及感染的重要因素，可加強對患者周圍環(huán)境消毒管理，以減少感染。

3.2 MLST MLST是一種基于核酸序列測定的細菌分型方法，其通過PCR擴增多個管家基因內部片段并測定相應基因序列，進而比較序列之間的差異，分析菌株變異，從而確定菌株之間的相關性［37］，具有操作簡單、檢測快等優(yōu)點，并便于在不同實驗室間進行比較。陳東科等［38］收集了全國49家醫(yī)院88株CRKP進行MLST，結果顯示，共有25個MLST型，其中ST11有48株（75.0%），源自18個城市32家醫(yī)院，說明ST11菌株為CRKP優(yōu)勢菌群并在全國范圍內廣泛流行。

3.3 WGS 基因組包含生物體全部遺傳信息，因此WGS能夠直接反映基因組DNA遺傳信息。研究表明，在確定細菌耐藥基因型、預測細菌耐藥表型方面，WGS特異度、靈敏度均較高，是一種簡便高效的檢測手段［39］。WGS不僅能對目前已知的耐藥基因簇進行篩選或確定已知耐藥基因耐藥表型，還能確定潛在或未知的基因簇或預測潛在耐藥機制［40-41］。DELEO等［42］對2株CRKP產KPC的ST258型KP與其他8個進行WGS的菌株比較，發(fā)現ST258有兩種不同遺傳分支，對診斷、治療和預防由多重耐藥CRKP引起的感染有重要作用。朱健銘等［43］采用WGS對廣泛耐藥KP JM45的質粒1（pJM45-1）進行分析發(fā)現，pJM45-1攜帶83個耐藥相關編碼基因，且與耐藥質粒R100有99%的序列相同，與接合性質粒F質粒有87%序列相同，與源自KP的質粒在同一簇，提示KP pJM45-1攜帶大量耐藥元件，是導致KP進化為廣泛耐藥的主要原因，同時其可導致耐藥基因在細菌間進行水平轉移，造成耐藥菌傳播。WGS雖是一種新技術，但其能夠較全面地反映細菌耐藥性及耐藥機制，確定細菌來源及傳播途徑，為臨床上阻斷細菌傳播、減少耐藥提供重要信息。

4 預防

我國CHINET結果顯示，臨床分離的克雷伯菌在2005—2014年對碳青霉烯類抗菌藥物的耐藥率增長幅度較大，但其他抗菌藥物的耐藥率變化不大，其中亞胺培南耐藥率從2.9%上升至10.5%，美羅培南耐藥率從2.8%上升至13.4%［44］。近年來，KP耐藥率不斷上升，導致CRKP廣泛傳播，給臨床治療帶來極大困難，因此采取積極有效的預防措施至關重要。

4.1 抗生素的合理應用 減少細菌耐藥的關鍵是抗生素的合理使用，臨床上使用抗生素時要有嚴格指征，按照細菌培養(yǎng)藥敏試驗結果選擇敏感抗菌藥物，盡量避免使用廣譜類抗菌藥物；還要遵循整療程原則，加強對使用抗生素的監(jiān)管，及時發(fā)現并糾正不合理用藥，以減少抗菌藥物濫用。目前，臨床針對CRKP多選用多黏菌素、替加環(huán)素和氨基糖苷類藥物。GHEITANI等［45］于2017在伊朗伊斯法罕收集兩家醫(yī)院100份樣本并鑒定產碳青霉烯酶的KP，通過評估黏菌素-美羅培南聯(lián)合治療結果發(fā)現CRKP 68株，其中21株對使用過的抗菌藥物表現出高度抗性，統(tǒng)計學結果顯示美羅培南和黏菌素有協(xié)同作用，提示臨床治療CRKP時可以加強此類藥物應用，并注重聯(lián)合應用。

4.2 加強感染控制措施 KARAMPATAKIS等［46］通過主動監(jiān)測計劃和常規(guī)感染控制措施，記錄了耐碳青霉烯類革蘭陰性菌發(fā)病率、患病率、定植壓力、感染和對感染控制措施依從性、增強感染控制措施，通過時間序列和中斷時間序列進行分析，結果顯示，在主動監(jiān)測計劃中增強感染控制措施使耐碳青霉烯類革蘭陰性菌發(fā)病率、患病率和定植壓力呈下降趨勢，其中CRKP感染從每1 000個病床日（IBD）19.6下降至8.1，說明加強感染控制措施，包括增強手部衛(wèi)生、積極監(jiān)測、加強預防措施、積極反饋政策和干預措施可以減少流行地區(qū)CRKP發(fā)生。劉曉翠等［47］對2015年1—10月神經重癥監(jiān)護室空氣環(huán)境、KP感染患者周圍空氣和病床單位進行細菌學監(jiān)測，結果顯示，KP能夠在神經重癥監(jiān)護室空氣環(huán)境和患者病床單位環(huán)境中定植生存并成為重要感染源，而神經重癥監(jiān)護室空氣傳播是KP感染的重要傳播途徑。所以，在臨床治療中要加強對患者的監(jiān)測，一旦發(fā)現CRKP應立即上報，做好病房及患者周圍環(huán)境的消毒，避免病房內患者間、醫(yī)護人員與患者間交叉感染，以減少CRKP的流行。

5 小結

近年來，CRKP的臨床流行和耐藥率呈上升趨勢，為減少其傳播首先應做好病房環(huán)境消毒，減少病房患者間交叉感染，避免醫(yī)護人員與患者間感染；臨床上應根據藥敏試驗結果選擇有效抗菌藥物，并盡量避免廣譜抗菌藥物的使用。質粒攜帶耐藥基因可以在不同細菌間發(fā)生水平轉移，導致CRKP耐藥性增強并易引起暴發(fā)和流行，因此臨床上應加強對質粒攜帶耐藥基因、質粒介導耐藥基因水平轉移進行研究，進而阻斷CRKP水平傳播。可以加強對CRKP質粒同源性的臨床研究，通過質粒酶切圖譜得到聚類分析圖，了解質粒間親緣關系，分析其流行和傳播特點，預見其傳播情況，在暴發(fā)流行早期及時制止；在暴發(fā)流行時可應用WGS以實時了解暴發(fā)情況，控制CRKP傳播、感染。