結直腸癌EMT相關LncRNA的研究進展

蘇 丹 何祖坤綜述 白 松審校

結直腸癌是最常見的消化系統惡性腫瘤之一，發病率呈逐漸上升趨勢，在全球范圍內為男性第3位、女性第2位，每年新發約120萬例，死亡約60 萬例[1]，在中國結直腸癌致死居于惡性腫瘤的第5位[2]。結直腸癌確切病因眾多且異質性強，目前認為主要是基因突變和基因表達水平綜合作用的結果[3-5]。雖然目前針對結直腸癌有多種療法，包括手術，化療及針對血管內皮生長因子受體(VEGF)、表皮生長因子受體(EGFR)和程序性細胞凋亡蛋白1(PD-1)/程序性細胞凋亡蛋白配體1(PD-L1)等靶點的靶向治療，患者通常還是會發生復發和轉移[6]。高的腫瘤分期(TNM3和4)、特定的定位(如左結腸)、組織學(腫瘤中基質細胞的含量)和微衛星不穩定性(MSI穩定)是惡化的標志。腫瘤的轉移是1個多步驟、多階段、多途徑、涉及多基因變化的一系列復雜過程，其中癌細胞的上皮間質轉化(EMT) 是造成轉移的重要機制，并且受到一系列基因表達變化的調控。LncRNA的主要功能就是通過調節基因轉錄相關的復合物活性及其他復雜機理控制下游基因的轉錄和表達，包括EMT相關基因。 近幾年，LncRNA(長鏈非編碼RNA)與結直腸癌關系的研究也逐漸增加,很多證據預示二者之間關系密切。

1 LncRNA的生物學功能

LncRNA是長度超過200個堿基，因缺少開放閱讀框不編碼蛋白質的RNA，可以位于細胞核內或胞質中。LncRNA參與了廣泛的生物途徑和細胞過程，具有保護蛋白編碼基因、參與X染色體沉默、基因組印記、染色質修飾、轉錄激活、轉錄干擾、核內運輸等生物學功能。根據與蛋白編碼基因的位置關系，可分為5種類型：正義、反義、雙向、內含子間和基因間LncRNA。形成方式有 5 種:①編碼蛋白質的基因在多種因素作用下斷裂后形成;②染色質重排過程中 2 個分開的區域緊靠到一起后通過轉錄形成;③非編碼基因轉錄;④小非編碼 RNA 中的某段序列多次復制;⑤轉錄因子中插入一段序列[7]。

Chew等[8]報道很多LncRNAs是蛋白質編碼的污染物，其主要通過基因組中的不同區域的RNA pol II轉錄，起初認為沒有實質性作用。但最近研究發現，LncRNA的變化和失調與不同癌癥的預后、轉移、復發有關。很多研究表明LncRNA在多種人類腫瘤中異常表達，其中在胃癌、乳腺癌、胰腺癌、肝細胞性肝癌、結直腸癌中研究頗多。所以LncRNA有望成為臨床上診療以上惡性腫瘤的生物標志物和治療靶點。

HOX轉錄反義RNA，即Hotair，是長度為2158 nt的LncRNA，包括5個短外顯子和1個長外顯子，位于染色體12q13,13區域。Hotair的5'端可以與PRC2(多梳抑制復合體2)相互作用，包含EZH2，SUZ12和EED 3個主要亞基，促進調控染色質組蛋白H3賴氨基酸27三甲基化(H3K27me3)，以沉默HOXD及其他靶基因轉錄；Hotair的3'端可與LSD1(稱賴氨酸特異性組蛋白去甲基化酶-1)結合，促進組蛋白H3K4去甲基化，以沉默抑癌基因轉錄表達[9-10]。Hotair基因結構具有高度保守性，但基因序列保真度低。其中，超保守序列與腫瘤中的原癌基因有關，抑制腫瘤細胞的凋亡，當其異常表達時可導致細胞惡變。

Hotair可作為不同類型癌癥的預后生物標志物，測量Hotair的表達水平有助于我們預測癌癥的階段并評估生存質量和生存期。

2 影響Hotair表達的主要相關因素

Hotair的表達主要通過兩方面的機制來調控，即轉錄水平的調控和轉錄后的穩定性調控和傳統的通過轉錄區域上游啟動子CPG島甲基化調控基因轉錄，Hotair的下游的CPG島DNA甲基化模式對其表達產生重要影響[11]。

除受到基因組特定區域甲基化影響，Hotair的轉錄水平也受到轉錄因子的調控。比如骨橋蛋白(OPN)，1個細胞外基質中的磷酸糖蛋白，可以轉錄激活并增加癌細胞中的Hotair的表達。CD44受體是OPN的正向調控因子，可間接影響Hotair的表達水平；相反，干擾素調控因子1(IRF1)通過綁定到啟動子上直接抑制Hotair的表達。實際上，OPN可以控制IRF1，通過影響其信號通路促進Hotair的表達，并抑制IRF的功能[12]。

C-myc與Hotair上游約1053處的E-box元件結合，上調Hotair的表達，通過siRNA敲低C-myc可減少Hotair的表達，降低其啟動子的活性，而C-myc上調則可增加Hotair的表達，并增加其啟動子的活性[13]。Cai等[14]發現，與Hotair表達水平低的人群相比，Hotair表達水平高的人群結直腸癌發生率更高。Alves等[15]研究了Hotair在 EMT中的作用及其在腫瘤干細胞(CSCs)的發生和維持中的作用，他們揭示Hotair通過觸發EMT和獲得干細胞特性在致瘤過程中起重要作用。

轉錄后Hotair的穩定性也受到其他因素的調控，例如 在microRNA-141的介導下，Hotair可被argonante2(Ago2)復合物抑制，進而降低Hotair在腫瘤細胞中的RNA穩定性和豐度。

3 與結直腸癌相關LncRNA

前報道與結直腸癌相關的LncRNA主要包括：H19、Hotair、MALAT1、MEG3、CCAT1、CRNDE、HuLc、KcNQ10T1、LncRNAP21、NPTN-IT1、SNHG16、ATB、LS1NCT5[16]。最新研究發現，SPRY4內含子轉錄本(SPRY4-IT1)、轉化生長因子β活化長鏈非編碼RNA(lncRNA-ATB)、TUG1和LINC01133在結直腸癌中表達上調，SLC25A25-AS1和LncRNA-CTD903表達下調可促進結直腸癌EMT的發生[17]。他們主要影響與結直腸癌相關的信號通路有：Wnt、RAS-MAPK、PI3k、TGF-β、P53。

3.1 H19與結直腸癌的相關性

H19 在細胞中的作用途徑很多，研究最為深入的主要是3個，一是Cai等[18]研究發現H19 作為miR-675 的前體，在分解過程中通過釋放miR-675來起作用。Tsang等[19]認為H19 通過其產物miR-675來抑制抑癌基因RB的表達，從而在結直腸癌的發生發展中可能起到一種癌基因的作用。有薈萃分析通過H19與結直腸癌患者預后的數據資料發現，H19 高表達組腫瘤分化較低，無病生存率(PFS)和總生存率(OS)均降低[20]。二是Liang等[21]研究報道H19可吸附并消耗miR-138和miR-200a從而發揮ceRNA的作用，促進EMT相關分子Vimentin，ZEB1和ZEB2的表達，從而抑制結直腸癌細胞的侵襲轉移；三是Han等[22]發現H19通過招募eIF4A3促進結直腸癌細胞的增殖。通常，周期蛋白包括G1期、S期和M期蛋白3種，CyclinD1可與CDK4特異性結合，形成CyclinD1-CDK4復合體，推進G1期向S期的進程[23]。 H19主要定位在細胞質中，siH19可使細胞周期G1到S期的進展受到阻滯，因此，推測H19通過在細胞質中發揮調控CyclinD1和CDK4的作用，從而影響結直腸癌細胞的增殖[24]。另外，Yoshimizu等[25]研究發現，小鼠結腸息肉數量上升伴隨著H19的顯著低表達，說明H19可能具有癌基因和抑癌基因的雙重作用。 Fellig等[26]通過檢測H19在37例結直腸癌并且肝轉移的肝轉移灶中的表達，發現50%存在高表達，這說明H19可以促進結直腸癌的肝轉移。以上研究結果顯示H19可能是結直腸癌潛在新癌基因和預后因子，有望成為未來檢測結直腸癌的生物標志物。

3.2 Hotair與結直腸癌的相關性

Kogo等[27]報道：Hotair上調與結直腸癌不良預后有關；認為HOTAIR與PRC2協同調控多種基因的表達，并可提高CRC患者未分化癌細胞的水平。Hotair誘導結直腸癌細胞中SUZ12，EZH2和PRC2的表達上調，從而增加H3K27me3修飾水平[28]。結直腸癌的發生發展是環境因素與遺傳因素共同作用下的過程?；虻倪z傳變異，如腫瘤相關的重要轉錄調控因子、信號通路、效應分子的單核昔酸多態性(SNP)，可通過影響基因結構而影響其功能，從而在環境因素的作用下發揮不同的效應，導致結直腸癌的發生。其中tagSNPS影響Hotair的基因組區域，通過改變Hotair的結構參與結直腸癌，其在癌癥中的作用僅有Zhang等報道[29]。 rs7958904位于Hotair基因的第6外顯子上，CC基因在老年受試者中對結直腸癌有顯著的保護作用[30]。rs7958904(影響Hotair)的CC基因型明顯降低結直腸癌的風險；rs4759314(影響Hotair)的GG基因型受試者患結直腸癌的發生率明顯低于攜帶AA基因型的受試者。研究結果顯示，Hotair的表達水平可作為判斷結直腸癌患者預后不良的新指標。

3.3 MALAT1與結直腸癌的相關性

Li等[31]發現，MALAT1 在結直腸癌耐奧沙利鉑細胞株中異常表達，對于高表達MALAT1的患者，MALAT1將EZH2與CDH1啟動子連接，并在奧沙利鉑治療期間抑制miR-218，最終促進結直腸癌細胞的EMT;但對于低MALAT1表達的患者，MALAT1不能抑制E-鈣粘蛋白和表達。ChIP實驗進一步驗證了MALAT1通過EZH2介導的H3K27me3在結直腸癌中形成來降低E-鈣粘蛋白表達。敲除MALAT1 后，結直腸癌細胞的E-cadherin表達增加、Vimentin 表達減少，細胞間連接增加，細胞的遷移和侵襲能力減弱。而奧沙利鉑則通過MALAT1 / EZH2途徑誘導結直腸癌細胞的化療耐藥。另一研究表明MALAT1通過增加AKAP-9的表達，在體外和體內促進結腸直腸癌(CRC)細胞增殖，侵襲和轉移[32]。Xu等[33]在研究結直腸癌轉移發生機制時，發現MALAT1 在50%的結腸癌樣本中呈高表達，并且MALAT1 的3'末端區域存在突變，進一步研究證明MALAT1 的3'末端區域突變在結直腸癌細胞的增殖、轉移和侵襲中起著重要作用。以上研究結果顯示MALAT1可能作為奧沙利鉑抗結直腸癌的治療靶點，同時可能成為診斷結直腸癌的新腫瘤標志物，具有臨床價值。

3.4 其他LncRNA與結直腸癌的相關性

近期研究發現，CCAT1在結直腸癌組織中表達明顯上調，且與腫瘤的侵襲和轉移相關，CCAT1較Hotair更有效早期發現結直腸癌。 ncRuPAR在結直腸癌組織中低表達，同時表達水平與腫瘤的轉移和預后有關。HOTTIP可以結合并靶向WDR5-MLL復合物至5'HOXA基因座，促進HOXA啟動子區域產生H3K4me3修飾從而轉錄激活[34]。HOTTIP影響結直腸腫瘤的大小和病理分期[35]，敲低 HOTTIP可抑制結直腸癌細胞的增殖和遷移，同時通過靶向SGK1抑制結腸癌細胞凋亡[36]。PRNCR1在結直腸腫瘤組織中的表達水平顯著高于癌旁組織[37]。BANCR在結直腸癌組織中低表達，并具有促進腫瘤細胞增殖的作用[38]。UCA1在結直腸癌組織和細胞系中表達明顯高于對照組，其作為潛在的分子病因學標志物，通過調節腫瘤細胞的細胞周期和細胞凋亡過程，對腫瘤的早期診斷和治療具有潛在的重要價值[39]。LncRNA-CCAL可通過靶蛋白AP-2α調節結直腸癌的發展進程，并激活Wnt/β-catenin通路。LncRNA-PCAT1與結直腸癌預后密切相關，可用于預測生存期[40]。

4 EMT

EMT是指上皮細胞轉化為具有間質表型細胞的生物學過程[41]。EMT被認為是腫瘤侵襲轉移的關鍵步驟[42]。當腫瘤細胞發生EMT 時，細胞的骨架發生重組，上皮細胞表型缺失，增強細胞間黏附的蛋白如E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、橋粒蛋白(desmoplakin，DP) 、閉鎖小帶蛋白-1(zonulaoccludens-1，ZO-1) 、緊密連接蛋白Claudin等表達減少，間質細胞的分子標志物如波形蛋白(Vimentin) 、纖維黏連蛋白(fibronectin，FN) 、基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMPs) 及N-鈣黏蛋白(N-cadherin) 等表達增加，從而導致細胞之間黏附能力下降或喪失，細胞間連接松散、失去極性，獲得更強的游走、抗凋亡及降解細胞外基質的能力，這是腫瘤發生周圍組織侵襲及遠處臟器轉移的重要生物學過程[43]。

目前,對腫瘤EMT的調控機制仍不明確,根據已有的研究表明,TGF-β、Wnt/β-catenin、Notch、Hedgehog、IL-6/STAT3以及NF-κB等信號通路可誘導EMT進程。EMT中所涉及的重要轉錄因子有:Snail1、Snail2、Twist1、Twist2、ZEB1和ZEB2等[44-45]。通過檢測與EMT相關的經典標志物在惡性腫瘤中的表達，從而明確其在惡性腫瘤預后中的作用，并試圖從中選出關鍵的分子，以篩選具有高轉移風險的患者群體，為患者的預后判斷、轉移預測、個體化治療等方面提供有效的證據。目前已有的研究顯示EMT與乳腺癌、結直腸癌、胃癌等多種癌癥的原發浸潤和繼發轉移都有著密切聯系[17,46-47]，但其具體發生機制還有待進一步的驗證。在惡性腫瘤中EMT發生發展的分子機制是當前研究的熱點。

5 LncRNA與EMT

ncRNA可通過內源性競爭miRNA，調控與EMT相關的一些轉錄因子的表達，進而影響EMT進程，最終改變癌細胞的侵襲和轉移能力[48]。Dou等[49]建立了Hotair表達沉默的裸鼠腸癌尾靜脈注射轉移模型，與對照組相比，Hotair敲低后，腸癌細胞肺部轉移灶減少。研究表明，Hotair通過參與結直腸癌細胞EMT事件，促進結直腸癌轉移的發生。此外，近期研究表明，MALAT1在甲狀腺癌、膠質母細胞瘤、結直腸癌等多種惡性腫瘤中均存在表達異常，參與到EMT過程中。

由此可見，LncRNA的表達對EMT起著重要的調控作用。但LncRNA調節EMT的機制十分復雜，且研究尚少，在未來的研究當中，研究者們致力于探尋更多與腫瘤EMT相關的LncRNA，探索其具體發生機制，將為LncRNA診斷治療腫瘤開辟更寬的路徑。

綜上所述，LncRNA和EMT在腫瘤發生發展中的關系逐漸受到重視，但其分子機制研究尚處于初級階段，LncRNA通過信號通路激活相關轉錄子的表達，影響上皮及間質細胞標志物的表達，調控EMT過程，但仍有大部分LncRNA在腫瘤中與EMT的關聯及其分子機制有待進一步研究。LncRNA的深入研究可以為結直腸癌及其他惡性腫瘤的特異性治療提供線索，有望成為腫瘤診斷及治療的新靶點。