關(guān)于滇重樓內(nèi)生真菌抗菌活性的篩選和菌株鑒定研究

代嬌 宋秋玲 田甜

摘要：采用實驗分析的方法，依靠實驗進(jìn)一步分析了滇重樓的真菌抗菌活性及其菌株鑒定結(jié)果。從實驗結(jié)果來看，滇重樓中的金黃色葡萄球菌具有理想的抗菌活性，并且菌株鑒定結(jié)果顯示，該菌株為墻粘鞭霉，因此應(yīng)該得到相關(guān)人員的關(guān)注。

關(guān)鍵詞：滇重樓;內(nèi)生真菌抗菌活性;菌株鑒定

前言：

滇重樓是一種廣泛分布于云南、貴州等地區(qū)的藥材，其根莖可以用藥，具有良好的清熱解毒、消腫止痛的功能，在臨床上常被用于治療咽喉腫痛、毒蛇咬傷等癥狀，其效果顯著。內(nèi)生真菌是指生活在植物組織內(nèi)部而不影響植物組織明顯癥狀的真菌，內(nèi)生真菌可以分泌毒素或者抗菌物質(zhì)，影響了藥物的臨床應(yīng)用。

1.實驗與材料分析

1.1原材料的選擇

在本次研究中，選取10株滇重樓為研究對象，所選藥物均為當(dāng)?shù)鼗瘜W(xué)與生物技術(shù)學(xué)院保存的菌種。

本次研究中的培養(yǎng)基為：PDA（馬鈴薯培養(yǎng)基）、NB（牛肉蛋白胨培養(yǎng)基）與固體發(fā)酵培養(yǎng)基。

1.2對原材料的處理

將本組10株滇重樓發(fā)酵物用95%乙醇浸泡之后，超聲處理30min，并用紗布做好過濾;之后取菌絲體，將其加入到80%的丙酮中進(jìn)行浸泡處理，在經(jīng)真空泵抽取之后，做好過濾。此時向濾液中添加100ml的乙醇乙酯，之后萃取乙酸乙酯層，并將其與萃取液合并在一次。之后萃取液在經(jīng)過40℃的減壓蒸餾之后，可以干燥處理，這樣就能獲得粗提取物浸膏。最后，提取100mg的提取物浸膏，并通過1ml無水乙醇完全溶解之后，將最終處理的后獲得的抗菌實驗樣品為實驗品。

1.3發(fā)酵物的抗菌活性檢測

采用濾紙片擴散法進(jìn)行發(fā)酵物的抗菌活性檢測，將試菌培養(yǎng)液均勻涂抹在抗菌實驗樣品上，之后在NB平板上的適當(dāng)位置粘貼蘸取了待測菌種發(fā)酵物乙醇提取物的濾紙片，同時選取100μg/ml無菌水與青霉素進(jìn)行對照，在37℃環(huán)境下來培養(yǎng)1d時間，觀察細(xì)菌的生長情況，并按照交叉法來測量抑菌圈的變化，評估抑菌效果。

1.4抗菌活性菌株鑒定

在本次研究中，為了能夠獲得更理想的抗菌活性菌株鑒定結(jié)果，需要對具有較高抑菌活性的真菌進(jìn)行形態(tài)學(xué)與分子學(xué)鑒定，這樣就能確定具體的抗菌活性水平。之后在對菌株的活性鑒定過程中，通過PDA培養(yǎng)基進(jìn)行插片，并按照分離后獲得的滇重樓植物內(nèi)生真菌的形態(tài)特征資料，并將最終的分析結(jié)果來進(jìn)行分屬鑒定。

2.對滇重樓內(nèi)生真菌抗菌活性的篩選和菌株鑒定結(jié)果的分析

2.1內(nèi)生真菌的抗細(xì)菌活性分析

在按照上述方法進(jìn)行實驗之后，對內(nèi)生真菌的抗菌活性情況進(jìn)行了分析，通過實驗結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，在本次所選擇的10株滇重樓中，由三株無抗菌活性，而另外7株只對黃金色葡萄球菌具有一定的抑制作用，并且對大腸桿菌與產(chǎn)氣腸桿菌無抑制作用，詳細(xì)資料如表1所示。

2.2抗菌活性的內(nèi)生真菌形態(tài)鑒定

在對抗菌活性的內(nèi)生真菌形態(tài)進(jìn)行鑒定之后，鑒定結(jié)果顯示，滇重樓菌株屬于粘鞭霉屬，這種真菌的主要特征為：培養(yǎng)過程中可以發(fā)現(xiàn)菌絲束，并且外表呈現(xiàn)出白色，且分生孢子聚集之后，其顏色相對暗（相關(guān)資料見圖1）。

2.3抗菌活性的內(nèi)生真菌分析鑒定

鑒定結(jié)果顯示，真菌中的PCR擴增條帶具有亮度高、特異性高等優(yōu)點，并且在對真菌的規(guī)格進(jìn)行分析之后，發(fā)現(xiàn)大部分真菌的大小為500-700bp。根據(jù)這一結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，本次研究中擴增出的序列可能為ITS序列，因此可以采用測序分析的方法類來進(jìn)行內(nèi)生真菌分析鑒定。之后，按照這一要求技術(shù)人員將測序的結(jié)果提交給GenBank，之后獲得具體的登入號。

2.4對分析結(jié)果的深入研究

滇重樓內(nèi)生真菌的活性篩選與菌株鑒定具有特異性，這一點在植物生長過程中，確實伴隨大量內(nèi)生真菌共生的情況，其中依然可以發(fā)現(xiàn)大量與宿主相同或者基本相似的生物活性物質(zhì)[1]。對于相關(guān)人員而言，必須要正確認(rèn)識到滇重樓的藥用價值，該藥物的根莖中含有足夠的甾體化合物，從臨床應(yīng)用情況來看，滇重樓具有理想的抗微生物、止血等作用。

結(jié)論：

從本次研究結(jié)果可知，滇重樓內(nèi)生真菌抗菌活性具有特殊性，可以帥篩選到了具有抗金黃色葡萄球均活性，并且研究結(jié)果也證明，滇重樓內(nèi)的次生代謝物中含有一定量的抗生素環(huán)孢菌素C，證明滇重樓內(nèi)的抗菌活性水平理想。因此在未來工作中，需要通過開展深入研究來判斷其次生代謝產(chǎn)物中的抗菌活性水平，這對于提高滇重樓的臨床藥用價值具有重要意義。

參考文獻(xiàn)：

[1]李靜.滇重樓內(nèi)生真菌及其抗菌活性檢測和甾體化合物分析[D].四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2017.