代謝組學在中醫寒、熱證型實質研究中的應用進展＊

錢文娟，林麗麗，汪受傳，狄留慶，單進軍＊＊

（1.江蘇省兒童呼吸疾病（中醫藥）重點實驗室，南京中醫藥大學中醫兒科學研究所 南京 210023；2.南京中醫藥大學藥學院 南京 210023）

寒、熱作為反映疾病性質的一對綱領，在指導疾病的診斷、治療過程中起著重要的作用。代謝組學可通過現代生物分析方法及生物信息分析策略研究生物樣本中代謝物的變化，尋找生物標志物，進而在代謝物及代謝通路水平上闡釋中醫寒、熱證型的實質，并建立精準量化的“證”的標準。本文總結了近年來基于代謝組學技術研究中醫寒、熱證型實質的研究，對所存在的問題及發展趨勢進行了分析與展望。

1 寒、熱證型簡介

寒熱理論源于《內經·陰陽應象大論》的“陽勝則熱，陰勝則寒”，《素問·五常政大論》提出“治熱以寒，溫而行之；治寒以熱，涼而行之”；自《傷寒論》起逐步完善，開創方藥，如半夏瀉心湯、大青龍湯、黃土湯等；確立于宋元明清等多位醫家著作，并不斷繼承創新至今，是貫穿于中醫學基礎理論的重要綱領，涉及中醫病、癥、證、治各個方面。

寒證，是疾病的本質屬于寒性的證候，可以由感受寒邪所致，也可以由機體自身陽虛陰盛而致，表現為機體機能活動衰減的證候。包括表寒、里寒、虛寒和實寒等證。寒證往往表現為無熱、惡寒、下利、不渴、小便清長、手足厥冷、面色蒼白、脈象微細等。熱證可以由外感陽熱之邪或寒濕等邪化熱，或氣郁化熱，或食積化熱等陽盛陰虛所致，表現為機體機能活動亢進的證候。包括表熱、里熱、虛熱和實熱等證。熱證常表現為高熱、便閉、口渴喜飲冷、小便短赤、顏面潮紅，脈象洪數等。

2 代謝組學簡介

代謝組學與基因組學、轉錄組學和蛋白質組學共同構成了系統生物學的核心內容。基因組、轉錄組及蛋白組為生物過程提供物質基礎，而代謝組信息則提示生物進程中已經發生的物質改變[1]。代謝組學分析流程包括樣本收集及預處理、檢測分析及數據采集和數據處理及解釋。代謝組學研究對象是小分子內源性代謝物，樣本包括體液（血液、尿液、唾液、淋巴液[2]、腦脊液[3]、關節腔液[4]等）、細胞、組織、糞便[5]等生物樣本。常用的代謝組學分析工具主要是質譜（MS）、液-質聯用（LC-MS）、氣-質聯用（GC-MS）和核磁共振技術（NMR）等。其中色譜具有分離度高、檢測效率高等特點；質譜可實現高選擇性和低檢測限；核磁共振具有非破壞性、非選擇性的優勢。數據處理的基本策略是化學計量學和多元統計結合[6]，對多維大數據進行降維和歸類分析，并根據P值、Fold Change值和VIP值篩選顯著改變的代謝物。同時，聯合應用代謝數據庫如NIST、HMDB、KEGG等搜尋代謝物相關生物功能及代謝通路，確定與疾病密切相關的潛在生物標記物（群）和代謝通路。

3 代謝組學與中醫寒、熱證型實質的關聯

中醫“證”是對當前病因、病位、病性、病勢等全局性的、病理性的概括。因此，對于中醫寒、熱證型實質的研究需從整體的角度出發。“證”的標準化、客觀化研究歷來是中醫研究的熱點[8]。從古至今，臨床中醫證型主要由醫者的主觀經驗判定，很難標準量化。臨床科研研究采用流行病學的方法，將中醫“望聞問切”四診所獲得的信息進行整理，總結出一些普遍性的臨床癥狀，建立診斷標準。但是這種診斷的準確性很大程度上依賴于醫生的臨床經驗，影響了“證”標準的可靠性與準確性[9]。因此，需要建立整體的、精準量化的中醫“證”的標準。

代謝組學，具有整體性和系統性的特點，已被廣泛運用到探索寒、熱證型的科學內涵中來。其通過高分辨、高通量、高靈敏度的分析手段，定性或定量監測體液、組織或細胞、菌群中內源性小分子物質（分子量＜1 kDa），探索機體在受到外部環境或疾病狀態影響下的動態變化，并找到潛在生物標志物（群）及相關代謝通路[10,11]。運用代謝組學技術可從代謝物及代謝通路角度闡釋中醫寒、熱證的本質，并建立精準量化的“證”的標準。

4 臨床寒、熱證實質的代謝組學研究

近年來，臨床上運用代謝組學研究疾病的寒、熱證型取得了重要進展，所研究的疾病類型多，涉及呼吸系統疾病（過敏性鼻炎、肺炎、支氣管哮喘）、痛經、關節炎、肝炎、腎炎、胃病、銀屑病及亞健康等。研究人員首先根據診斷標準篩選研究對象并分組。在診斷標準中，包括疾病西醫診斷標準、中醫證型診斷標準及病例納入排除標準。其次是樣本采集，臨床上采集的樣品主要是晨起空腹血和尿。最后利用GC-MS、LC-MS及1H-NMR技術對寒證患者及健康志愿者，熱證患者及健康志愿者或同一疾病下寒、熱證型的患者的生物樣本進行分析，監測出寒、熱證代謝譜的差異，獲得與人體疾病、證型分類密切相關的生物標志物（群）。關于寒、熱證型的臨床代謝組學研究見表1。綜合寒、熱證代謝譜中顯著性改變的代謝物可見，氨基酸、糖、脂質、脂肪酸及胺類的代謝紊亂，主要參與的代謝通路有氨基酸合成、氮代謝、甘氨酸，絲氨酸和蘇氨酸代謝、丙氨酸，天冬氨酸、谷氨酸代謝、酮體合成和降解、牛磺酸和亞牛磺酸代謝、半乳糖代謝、糖酵解和糖異生及丙酮酸代謝等，同一證型下不同疾病的代謝物改變趨勢不同，如原發性痛經的寒證證型中，虛寒和實寒的患者與正常機體間的差異性代謝物均有乳酸、葡萄糖、果糖、異檸檬酸、甘氨酸、原藻醇和馬尿酸，但是代謝趨勢相反；又如虛寒證中，過敏性鼻炎的代謝組學研究中肌醇的含量顯著升高，而類風濕性關節炎的代謝組學研究中，肌醇的含量顯著降低，提示“虛、實”證、不同疾病（“臟、腑”）可影響寒、熱證代謝表型，影響寒、熱證型實質的研究。

5 動物模型寒、熱證實質的代謝組學研究

中醫證候動物模型是在中醫整體觀念及辨證施治思想的指導下，運用臟象學說和中醫病因、病機理論，在動物體上模擬和復制人類各種臨床癥候[12]。建立相應的中醫證候動物模型，分析其生物樣本，篩選出中醫證候相關生物標記物，有利于進一步探索寒、熱證型實質，為臨床診斷及治療提供依據。一般將造模方法劃分為西醫病因病理造模、中醫病因病機造模和病癥結合造模3類，具體的造模方法多樣，包括使用生化制品或中藥制劑、調控飼養環境、情志刺激等[13]。在動物模型寒、熱證的代謝組學研究中（表2），動物模型多樣，包括西醫病因病理模型如干酵母熱證模型；中醫病因病機模型如寒冷環境聯合冰水游泳及寒冷飲食的外寒內飲證模型和病癥結合模型如高糖高脂、高溫高濕聯合大鼠腹腔注射產腸毒性大腸桿菌的大腸濕熱模型。動物模型中顯著改變的代謝物主要是氨基酸、糖、脂質、脂肪酸及胺類等，代謝物主要參與的代謝通路有TCA循環、甘氨酸，天冬氨酸和谷氨酸代謝、氨基酸合成等，但是同一疾病模型不同的造模方式所獲取的代謝物改變趨勢不同，如類風濕性關節炎寒證模型中，采用卵蛋白聯合低溫冷凍造模方法時，代謝物亮氨酸含量顯著升高，棕櫚酸含量顯著降低，而使用牛Ⅱ膠原蛋白聯合弗氏完全佐劑造模方法時，亮氨酸含量則顯著降低，棕櫚酸含量顯著升高，提示采用動物模型研究寒、熱證實質時，代謝組學研究所篩選得到的寒、熱證潛在生物標記物（群）和代謝通路還不能直接用于揭示人體寒、熱證實質。

表1 臨床寒、熱證的代謝組學研究

續表1

表2 動物模型寒、熱證代謝組學研究

續表2

6 問題與展望

目前代謝組學技術已廣泛應用于探索中醫寒、熱證型實質并取得一定成就，但依然存在問題：（1）單純使用一種分析儀器或方法，只能得到部分代謝物的信息，致使同一樣本應用不同分析方法找出的生物標記物（群）不同。因此，需結合多種分析技術進行代謝物全譜的檢測：可采用LC-MS技術和NMR技術相結合[14]，GC-MS技術和LC-MS技術聯合[15]，綜合非靶向和靶向代謝組學模式[16]，增強代謝物檢測覆蓋率。（2）寒、熱證動物模型的建立與評價仍處于探索階段，對于動物證候模型的評價指標及可重復性存在爭議，證候動物模型對人體臨床證候的模擬程度也未得到公認。因此，對造模動物進行代謝組學研究所篩選得到的寒、熱證潛在生物標記物（群）和代謝通路還不能直接用于揭示人體寒、熱證實質，仍需進一步結合臨床研究。（3）同一證型下不同疾病所得潛在生物標記物（群）種類差別大，且回調趨勢不一致，難以解釋寒、熱證型規律及實質。因此，需采用代謝組學聯合蛋白質組學、基因組學、轉錄組學等多組學研究方法，從基因-轉錄-蛋白-代謝角度整體探索寒、熱證實質。