受體色譜：中藥靶向活性成分高效篩選技術＊

劉嘉君，賈曉妮,2，王 靜，曾凱竹，李 倩，趙新鋒＊＊

（1.西北大學藥學院 西安 710069；2.西安市精神衛所中心 西安 710100）

中醫藥是我國的民族特色和寶貴財富，為防治重大疾病做出了重要貢獻。作為中醫臨床主要用藥形式，中藥復方具有組成復雜、辯證靈活、化學成分多樣及作用機理復雜等特點[1]，使得其活性成分篩選發展成為復雜性科學問題。目前，中藥活性成分篩選方法主要包括整體動物模型、細胞模型、酶和受體模型、基因芯片、傳統生物色譜和計算機模擬等技術。上述方法為中藥活性成分篩選做出了重要貢獻，但在篩選速度、特異性和效率等方面尚需進一步的工作[2]。因此，中藥活性成分篩選依然是中醫藥現代化研究領域的熱點之一，迫切需要在理論、原理和方法方面進行突破，推動以中藥為源泉的創新藥物研發進程。

1 受體色譜的內涵及外延

1.1 受體色譜概念

眾所周知，G-蛋白偶聯受體為人體內最大一類細胞膜受體，介導多種重要生理功能，是藥物發揮藥效的主要靶點。藥物進入體內后與受體通過親和作用形成穩定復合物，啟動下游級聯式信號轉導通路發揮藥效。針對傳統中藥活性成分篩選方法在藥物活性成分篩選方面周期長、準確率低和后期臨床研究風險大等問題，筆者課題組通過歸納分析體內藥物與受體作用過程的特點和傳統色譜技術的優缺點，發現體內藥物-受體作用過程與色譜系統溶質的吸附-解離行為極為相似，將受體識別藥物的高特異性和色譜技術的高分離能力相結合，提出了受體色譜新概念[2-10]。其內涵是將藥物靶蛋白識別藥物的特異性作為色譜保留行為的本質，延續了色譜技術的高分離能力，凸顯了藥物識別的靶向性特征，減少了藥物篩選的盲目性，提高了藥物篩選的準確性。其外延可將任意靶蛋白、DNA等大分子或生物分子固載于色譜填料表面，應用于復雜體系中其特異性配體的分離分析，服務于中藥及其復方關鍵功效物質解析。

1.2 受體色譜的特點

由于受體色譜集成了受體識別藥物的高特異性和色譜技術的高分離能力，具有高靈敏度、高特異性、高穩定性和高靶向預測能力，已成為藥物-受體相互作用在線分析和復雜體系藥物活性成分高效篩選的重要方法之一[3-10]。其概念的提出，拓展了親和色譜研究范疇，更明確地表達了親和色譜的功能性特征。與傳統色譜技術相比，受體色譜具有以下優勢：①受體分子通過溫和的固定化方法鍵合在固定相表面，可保證較高的柱效；②受體經固定化后所處的膜脂質微環境與在細胞膜上微環境相似，穩定性好，可多次重復使用；③可采用色譜學方法對固定化受體的構象及取向進行梳理、調控、優化，最大程度模擬體內受體-藥物的相互作用；④可用于中藥復雜體系藥物活性成分高效、靶向篩選及藥物-受體相互作用快速分析。

1.3 受體色譜的發展

歷經十余年的發展，筆者課題組以呼吸系統疾病藥物靶點β2-腎上腺素受體（β2-AR）及心腦血管疾病藥物靶點α1-腎上腺素受體（α1-AR）、血小板受體P2Y12（P2Y12R）、內皮素受體（ETA和ETB）、血管緊張素II受體I型和II型受體（AT1和AT2）為例，建立了系列受體色譜模型（圖1）。利用上述色譜模型，建立了系列受體-藥物快速和精準分析色譜方法，開展了系列固定化受體-藥物相互作用研究，篩選了系列中藥單體和復方活性成分，證明受體色譜可成功應用于受體-藥物相互作用研究和中藥活性成分靶向篩選。該方法為受體-藥物相互作用高通量分析和復雜體系藥物活性成分高通量和高內涵篩選提供了可靠方法。

2 受體色譜模型的建立

2.1 受體固定化方法

受體固定化方法包括物理吸附、隨意固定和定向固定三類。物理吸附法操作簡便，蛋白質固載量大，但受體與固體材料通過吸附作用結合較弱，易流失；隨意固定化法利用受體自身氨基、羧基及巰基與固體材料表面醛基等發生共價反應，反應效率高，但無位點特異性，受體構象雜亂不易，活性位點損失嚴重；定向固定化法利用受體結構中融合生物素、谷胱甘肽S-轉移酶和組氨酸標簽（His-tag）等分別與親和素、谷胱甘肽和鎳離子修飾的固體材料發生親和作用進行固定化，能統一固定化受體取向，減小活性位點損失，但仍存在耐鹽程度低和穩定性差等不足。

2.1.1 受體高容量定向固定化法

為解決受體鍵合量問題，筆者課題組通過原子轉移自由基聚合反應對固定相表面進行接枝改性，通過重氮鹽反應和鎳離子螯合反應將His-tag融合受體定向固載于改性修飾后的色譜填料表面，建立了高密度His-tag功能蛋白質定向固定化色譜固定相制備方法[5,10]。該方法不僅確保了固定相表面受體取向和構象的一致性，而且減少了活性位點損失，顯著提高了受體固載量。

2.1.2 受體密度可控一步固定化法

傳統受體固定化方法實施的前提是獲得高純度受體，主要通過三步柱色譜法實現。為了避免受體分離純化過程導致的活性損失，筆者課題組受生物正交反應啟發，分別將О6-鳥嘌呤-DNA-烷基轉移酶（SNAP-tag）和脫鹵素酶（HALO-tag）融合至受體末端，利用兩種酶與其底物的特異性共價反應，將受體固載于底物修飾的固體填料表面，建立了密度可控、高特異性和單層均一的受體一步固定化方法[2]。由于此類反應特異性高，可直接將目的蛋白從細胞裂解液中以共價鍵捕獲至固體填料表面，最大限度減少了受體活性損失，具有快速、可靠、選擇性強和固定化效率高的獨特優勢。

2.2 受體色譜固定相表征

固定化受體的生物活性是成功構建受體色譜模型的重要依據之一，其表征方法是分析化學和藥物分析領域面臨的難點問題之一，目前尚未檢索到有效的方法。圍繞該問題，筆者課題組分別從形態學和生物活性方面開展了較為系統的工作，建立固定化受體色譜固定相形態學、取向、構象和活性綜合表征方法學。

2.2.1 形態學表征

形態學表征主要表征固定化受體色譜固定相的物理化學性質，可用經典的化學表征方法實現。具體而言，用光電子能譜表征固定化色譜固定相的內部和外部元素組成[2]，用透射電子顯微鏡和掃描電子顯微鏡表征其內外部形貌。

2.2.2 取向及構象表征

以受體特異性抗體為分子探針，建立了以容量因子、結合常數和熱力學參數為指標的固定化受體取向及構象表征方法；創新性地將激光共聚焦顯微鏡應用于固定化受體位點特異性取向及構象變化活性表征中，以Cy5等熒光染料為探針，以熒光信號強弱為指標，發現固定化受體具有配體誘導的構象變化活性[2]。

圖1 受體色譜模型的構建及應用

2.2.3 活性表征

以受體激動劑、部分激動劑和拮抗劑為工具藥，研究其與固定化受體相互作用的熱力學和動力學，對受體配體識別活性進行表征；以受體下游偶聯蛋白Gs，Gi和Go等及其相關活性短肽為探針，獲得其與固定化受體相互作用過程的熵變，對受體下游信號轉導活性進行表征，建立了固定化受體配體識別活性和信號轉導活性表征方法，為在線表征固定化受體色譜雙元活性提供了方法[2]。

3 受體色譜模型的應用

3.1 受體-藥物相互作用研究

受體-藥物動態識別行為及其介導的信號轉導過程對于闡明受體結構與功能、揭示藥物體內作用機制、發現藥物新靶標、指導后期臨床用藥和開發創新藥物具有重要意義。筆者課題組通過系列研究，證明受體色譜在受體-藥物相互作用快速分析方面具有廣闊的應用前景。

3.1.1 經典前沿分析和競爭置換法

從作用機理分析，受體色譜系統受體-藥物相互作用推動力為弱分子間作用力，筆者認為，經典的前沿分析與競爭置換法同樣適用于受體色譜。據此，筆者以α1A-AR和β2-AR為例，分別采用前沿分析和競爭置換法研究了不同工具藥與兩種受體的相互作用，測定了不同工具藥在兩種受體色譜柱上的熱力學平衡常數等參數，與放射性配體免疫法所得結果高度一致，證明受體色譜法可用于受體-藥物相互作用研究[6,8]。

3.1.2 直接進樣法

針對經典前沿分析法和競爭置換法分析時間長和配體用量大的不足，筆者建立了基于配體進樣量與容量因子依賴關系的直接進樣法數學模型，該模型不需用大量配體飽和色譜柱，只需進樣不同濃度的配體，即可快速分析受體-配體的相互作用，獲得其相互作用參數，特別適用于來源困難或珍貴配體的分析[4,5]。

3.1.3 非線性色譜法

受體-配體相互作用的熱力學參數主要探討結合反應發生的可能性，而動力學參數主要判斷配體成藥的可行性。為了克服前沿色譜法等方法缺乏受體與藥物相互作用熱力學參數的不足，筆者將非線性色譜法引入至受體-藥物相互作用研究，證明該方法不僅能準確測定平衡常數，而且能同步獲得受體與配體的結合速率參數，為蛋白質-藥物相互作用參數的全面測定提供了借鑒[6,7]。此外，該方法同樣不需用大量配體飽和色譜柱，能有效彌補前沿分析和競爭置換在分析時間長和藥物用量大等方面的不足。

3.1.4 吸附能量分布模型

吸附模型的正確選擇對受體-藥物相互作用精準分析意義重大。筆者課題組將吸附能量分布模型（AED）引入至β2-AR與藥物的相互作用研究，通過系統的AED計算，對直接前沿分析和位點特異性競爭前沿分析色譜-質譜所得吸附數據進行了分析，獲得最佳吸附模型，準確測定受體-藥物相互作用參數[3]。結果發現，該方法所得結果更接近于放射性配體免疫法，結果的準確性和精確度均高于競爭置換法和前沿分析法等傳統方法。其原因可能在于色譜固定相的改進、方法靈敏度的提高以及數學模型的優化。更為重要的是，藥物在受體色譜柱上的保留時間變化率可用于預測藥物與受體的作用力。方法只需單次進樣，即可同時鑒定競爭劑與受體的結合位點并預測競爭劑的受體結合活性，能夠精準分析G-蛋白偶聯受體-藥物相互作用。

3.2 中藥復方活性成分篩選

3.2.1 單靶點活性成分篩選模型

受體色譜法兼具色譜技術的高分離能力和受體與藥物識別過程的高特異性，在活性成分篩選的同時進行分離鑒定。筆者課題組采用β2-AR色譜柱對多種中藥提取液進行分析，篩選了可與該受體特異性結合的活性成分，利用反相高效液相色譜-離子阱質譜聯用法對活性成分進行了在線分離與鑒定。結果發現2，3-亞甲基二氧-9-甲氧基-原小檗堿、黃連素、巴馬汀和藥根堿為黃連中可與β2-AR相互作用的活性成分，芥子堿硫氰酸鹽和芥子酸膽堿為白芥子中與β2-AR靶向活性成分，證明受體色譜法可用于篩選中藥中的活性成分[9]。

3.2.2 多靶點活性成分篩選模型

上述篩選研究證明，受體色譜可用于中藥活性成分篩選。然而，從篩選機理分析，一類受體色譜僅能發現中藥中的一種或一類生物分子，無法滿足多種類、多靶點中藥活性分子的篩選。如果能將不同受體色譜柱在線組合，就能建立多維受體色譜模型[9]，應用于中藥多種類、多靶點活性成分篩選。據此，筆者將α1-AR和β2-AR色譜柱在線串聯，當藥物供試品進入α1-AR柱后，在α1-AR柱上不保留成分可切換至β2-AR色譜柱進行分析，從而實現篩選作用于兩類受體的活性成分；另一方面，在α1-AR柱上保留的成分，也可以再次切換至β2-AR柱，獲得同時作用于2種受體的多靶點成分。利用該方法，筆者證明黃連中小檗堿、巴馬汀和藥根堿為同時作用于2種受體的活性成分。

3.2.3 熱病理狀態活性成分篩選

生物醫學研究表明，蛋白質空間構象異常變化是眾多疾病的發病機制之一，而疾病引起的體溫改變會調控蛋白質的構象。筆者以固定化β2-AR為例，采用受體色譜模型研究了溫度誘導的受體構象變化，證明探針藥物手性對映體麻黃堿和偽麻黃堿在色譜柱上的分離度可用于表征熱病理狀態下固定化受體的構象，為體內熱病理狀態下藥物活性成分高效篩選提供了新的思路[10]。

3.2.4 位點特異性競爭活性成分篩選模型

受體色譜篩選藥物活性成分的本質是固定化受體-藥物結合解離行為，缺乏目標成分激動或拮抗活性的直接信息。筆者課題組采用位點特異性競爭前沿色譜-質譜技術對6種藥物混合物進行了篩選[3]。結果發現，芍藥苷和甘草苷與沙丁胺醇競爭性結合受體上同一類位點，提示2種成分具有β2-AR激動活性，證明該方法在復雜體系藥物活性成分篩選的同時，能有效判定目標成分的激動或拮抗活性及準確作用位點，為建立基于受體色譜-質譜聯用法的高內在活性藥物成分篩選提供了依據。

4 展望

自受體色譜概念提出至今，筆者課題組圍繞受體色譜在受體-藥物相互作用和中藥活性成分篩選方面開展了大量工作，取得了一定的研究結果。然而，作為一種以廣泛應用為導向的新方法，受體色譜尚需進一步完善和提升：①多靶點協同起效是中藥主要作用特征。以中藥為源泉進行靶向活性成分篩選，亟需增加受體種類，發展多維色譜系統，以滿足多種類和多靶點篩選要求；②配體的受體識別結合參數僅是藥物活性的判定指標之一。受體色譜柱中的保留成分是否具有內在活性，尚需發展多元化的指標加以探討。若藥物在色譜柱上的保留行為與受體下游信號轉導通路關聯，有望通過色譜法獲得活性成分更豐富的活性信息；③發展新型受體制備、固定化和藥物成分篩選方法，實現藥物活性成分智能篩選，以降低受體色譜對人員技術的要求，達到廣泛推廣的目標。